響應(yīng)面優(yōu)化混菌發(fā)酵蜂王幼蟲制備抗氧化肽及其結(jié)構(gòu)鑒定

蜂王幼蟲又稱蜂子、蜂王胎或蜂皇胎，由蜜蜂的受精卵孵化約3日齡而成的幼蟲體，始終以工蜂分泌的蜂王漿為食物，是蜂王漿生產(chǎn)過程中的必然產(chǎn)品。我國蜂王漿年產(chǎn)量約3 000 t，產(chǎn)量和出口量占全球總量的90%以上，一般每生產(chǎn)1 kg蜂王漿，可收獲蜂王幼蟲0.2～0.3 kg[1]。蜂王幼蟲營養(yǎng)成分豐富，是一類高蛋白且氨基酸組成全面、維生素含量豐富的可食用昆蟲，然而其蛋白制品通常只是進(jìn)行簡易的加工，技術(shù)含量和附加值低，近年來蜂王幼蟲肽產(chǎn)品開發(fā)受到關(guān)注。主要研究側(cè)重于不同的商業(yè)酶酶解蜂王幼蟲的工藝優(yōu)化以及活性研究，但得到的多肽抗氧化活性并不強(qiáng)，對多肽的結(jié)構(gòu)表征也少[2]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，從蠶蛹、蜂蛹、黃粉蟲等昆蟲蛋白中制備得到的活性肽均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，生產(chǎn)應(yīng)用前景廣闊[3-5]。蜂王幼蟲和蜂蛹相似，都是蜜蜂發(fā)育過程中的幼蟲體，富含高度同源的蛋白質(zhì)，值得開發(fā)利用，而且我國蜂王幼蟲資源充足，與畜牧行業(yè)生產(chǎn)動(dòng)物性蛋白相比碳排放量低，可實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)，有工業(yè)化生產(chǎn)潛力，然而大多數(shù)的蜂王幼蟲蛋白資源仍未得到有效利用。相比酶解法，微生物發(fā)酵法所產(chǎn)蛋白酶系豐富，能將微生物產(chǎn)酶和酶解蛋白工藝同時(shí)進(jìn)行，酶解效率更高，省去酶的分離和提純的步驟，降低了生產(chǎn)成本[6]；微生物發(fā)酵法在蜂王幼蟲活性肽產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用上研究較少，這也為工業(yè)化生產(chǎn)蜂王幼蟲活性肽提供一條可行的途徑?？莶菅挎邨U菌和黑曲霉都是蛋白酶分泌能力強(qiáng)的菌株[7]，根據(jù)它們的產(chǎn)酶特點(diǎn)復(fù)配使用，理論上會使多肽不僅得率高而且風(fēng)味好。蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生小分子的活性肽和氨基酸[8]，蛋白酶活力和多肽的產(chǎn)率成正比，要提高多肽的得率就要調(diào)控發(fā)酵條件提高微生物產(chǎn)蛋白酶的活力。本文利用枯草芽孢桿菌和黑曲霉復(fù)配發(fā)酵蜂王幼蟲凍干粉制備抗氧化肽，重點(diǎn)研究不同發(fā)酵條件對多肽得率和發(fā)酵體系中蛋白酶活力的影響，并對目標(biāo)抗氧化肽進(jìn)行分離純化，測定其體外抗氧化活性并表征其結(jié)構(gòu)，期望為蜂王幼蟲的生物活性研究、開發(fā)高營養(yǎng)、高附加值的產(chǎn)品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

蜂王幼蟲凍干粉，湖北某蜂業(yè)公司；枯草芽孢桿菌M2020782,本實(shí)驗(yàn)室從蜂糧中分離鑒定，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；黑曲霉91006，中國典型培養(yǎng)物保藏中心；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-30S立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-160全溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；Allegra X-15R低溫高速離心機(jī)，美國貝克曼公司；BONA-GM-18有機(jī)膜分離試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司；A300全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；AL204真空冷凍干燥機(jī)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Ultimate 3000液相色譜儀、Q Exactive質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備[7]

挑取3～5環(huán)活化后的菌種接于已滅菌的裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)一段時(shí)間，即得到種子液。

1.2.2 制備工藝

蜂王幼蟲粗肽樣品制備工藝如下：

蜂王幼蟲凍干粉→加水混合(發(fā)酵總量50 mL/250mL錐形瓶)→高溫滅菌(105 ℃，20 min)→接種→發(fā)酵→沸水浴(100 ℃，15 min)→冷卻→離心(4 000 r/min，15 min)→取上清液→蜂王幼蟲粗肽樣品

1.2.3 蜂王幼蟲多肽得率的測定

參考徐萍[9]的方法測定蜂王幼蟲多肽得率，以肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)Y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.063 7x-0.001 8(R2=0.998 7)。

樣品的測定：取2 mL發(fā)酵上清液，加入1 mL 10%的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)，混勻后靜置30 min，沉淀大分子蛋白，4 000 r/min離心15 min，取上清液1.5 mL，并加入1 mL雙縮脲試劑[V(樣液)∶V(雙縮脲試劑)=3∶2]，混勻后室溫靜置30 min，測定540 nm處的吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液多肽濃度。根據(jù)公式(1)計(jì)算多肽得率：

多肽得率

(1)

式中：c，發(fā)酵液中多肽質(zhì)量濃度，g/mL；V，發(fā)酵粗肽液體積，mL；X1，蜂王幼蟲蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m，蜂王幼蟲原料質(zhì)量，g。

1.2.4 蛋白酶活力的測定

參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法進(jìn)行測定。根據(jù)不同L-酪氨酸濃度對應(yīng)波長680 nm處的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007 1x-0.001 2(R2=0.999 7)。

1.2.5 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

在發(fā)酵總量50 mL、料水比5%、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、pH為6.5、發(fā)酵溫度30 ℃、初始枯草芽孢桿菌∶黑曲霉復(fù)配體積比=2∶1、接種量5%(體積分?jǐn)?shù))、發(fā)酵時(shí)間60 h等基礎(chǔ)條件下，考察復(fù)配體積比(1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、1∶3)、接種量(3%、5%、7%、9%、11%)和發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60、72 h)對發(fā)酵液多肽得率和蛋白酶活力的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法中Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

1.2.6 氨基酸組成的測定

測定參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。

1.2.7 超濾分離

在室溫條件下，選擇10、5、3、1 kDa的卷式超濾膜將發(fā)酵液進(jìn)行逐級分離，分別得到5個(gè)分離級分，分別是分子質(zhì)量>10 kDa的組分F5，5～10 kDa的組分F4，3～5 kDa的組分F3，1～3 kDa組分F2，<1 kDa組分F1。濾液流速為0.5～8 L/h，膜元件壓力0～0.8 MPa。將收集到的各個(gè)組分濃縮、真空冷凍干燥得到各組分的凍干粉，-20 ℃保存，測定其抗氧化活性。

1.2.8 體外抗氧化活性測定

1.2.8.1 DPPH自由基清除率的測定

將經(jīng)過超濾處理的不同組分的粗多肽凍干粉依次配成0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL的多肽液。參考涂宗財(cái)?shù)萚10]的方法，分別測定50 μL各濃度待測粗肽液與150 μL的0.2 mmol/L DPPH反應(yīng)后吸光值A(chǔ)1。以50 μL去離子水與150 μL DPPH溶液混合作為空白對照組A2，以50 μL粗肽樣品與150 μL 95%乙醇混合作為本底對照組A0。按公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率

(2)

計(jì)算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，IC50越小表示DPPH自由基清除力越強(qiáng)。

1.2.8.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

稱取經(jīng)過超濾處理的不同組分蜂王幼蟲粗多肽凍干粉，分別配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL多肽液，參考白海娜等[11]的方法，分別測定50 μL各濃度待測粗多肽液與100 μL ABTS陽離子工作液反應(yīng)后的吸光值A(chǔ)1，以50 μL去離子水與100 μL ABTS陽離子工作液混合作為空白對照組A2，以50 μL粗肽樣品與100 μL去離子水作為本底對照組A0，按公式(3)計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率：

ABTS陽離子自由基清除率

(3)

1.2.8.3 還原力的測定

參考LASSOUED等[12]的氰化鉀氧化法，向試管中加入1 mL 2 mg/mL粗多肽液并依次加入各反應(yīng)液后，靜置10 min，以蒸餾水代替樣品作為空白，700 nm測定吸光值，吸光值越大，說明樣品還原力越強(qiáng)。

1.2.9 蜂王幼蟲低聚肽序列LC-MS/MS鑒定[13]

抗氧化活性最好的超濾組分多肽序列采用LC-MS/MS進(jìn)行鑒定。色譜條件：流動(dòng)相：流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相B：0.1%甲酸、80%乙腈(acetonitrile，ACN)，流速300 nL/min；洗脫時(shí)間0～5 min，5% B；5～45 min，5%～50% B；45～50 min，50%～90% B；50～55 min，90%B；55～65 min，90%～5% B。質(zhì)譜條件：分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive進(jìn)行在線檢測，參數(shù)如下：(1)一級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：70 000；自動(dòng)增益控制(auto gain control，AGC)target：3e6；最大駐留時(shí)間(maximum IT)：40 ms；掃描范圍：100～2 000 m/z；(2)二級質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：17 500；AGC target：1e5；最大IT：60 ms；TopN：20；NCE/stepped NCE：27。數(shù)據(jù)庫檢索軟件為Mascot。

1.2.10 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用IBM SPSS Statistics 20.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示各組數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表采用GraphPad Prism 8繪制及Design Expert 10進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 復(fù)配比對混菌發(fā)酵蜂王幼蟲凍干粉的影響

枯草芽孢桿菌和黑曲霉所產(chǎn)蛋白酶的性質(zhì)差異較大，前者主要為內(nèi)肽酶，而且蛋白酶活力高，能夠增加蜂王幼蟲多肽的產(chǎn)率，但發(fā)酵產(chǎn)物臭味重，很難除去；后者則為端肽酶，可以改善蜂王幼蟲多肽的風(fēng)味。由圖1可知，當(dāng)枯草芽孢桿菌的接種量≥黑曲霉時(shí)，多肽得率和酶活力較高，在接種比為2∶1時(shí)，達(dá)到最大值。這一結(jié)果與采用用枯草芽孢桿菌和黑曲霉混合發(fā)酵綠豆蛋白粉時(shí)結(jié)果吻合，同樣是枯草芽孢桿菌比例高時(shí)多肽濃度更高[14]。這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌在發(fā)酵初期利用營養(yǎng)物質(zhì)及生長繁殖能力強(qiáng)于黑曲霉，會成為主要優(yōu)勢菌，增加多肽的產(chǎn)率。選擇枯草芽孢桿菌與黑曲霉的接種比例為1∶1、2∶1以及3∶1作為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖1 復(fù)配比對酶活力和多肽得率的影響
Fig.1 Effect of Bacillus subtilis to Aspergillus niger ratio on enzyme activity and peptide yield
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 接種量對混菌發(fā)酵蜂王幼蟲凍干粉的影響

適宜的接種量可以將微生物的延滯期變短，能更快利用底物進(jìn)行發(fā)酵。如圖2所示，在接種量為3%～7%時(shí)，發(fā)酵液的多肽得率和蛋白酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢，達(dá)到7%后，隨著接種量的增加，其多肽得率和酶活力不再增加。這一變化趨勢與枯草芽孢桿菌發(fā)酵燕麥制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)肽接種量與多肽得率變化結(jié)果相似[15]。當(dāng)接種量濃度太低時(shí)，底物中的蛋白質(zhì)無法被枯草芽孢桿菌和黑曲霉完全利用，只有部分得到水解；接種量超過一定濃度時(shí)會使微生物生長繁殖過快，得到的蜂王幼蟲多肽可能會被菌體優(yōu)先利用，此外培養(yǎng)基黏度增大，溶解氧不足，微生物生長受到抑制，導(dǎo)致酶活性和多肽得率不高。根據(jù)接種量對發(fā)酵產(chǎn)物的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)中接種濃度選定為5%～9%。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對混菌發(fā)酵蜂王幼蟲凍干粉的影響

合理把控發(fā)酵時(shí)間是在充分發(fā)酵物料的基礎(chǔ)上，避免營養(yǎng)物質(zhì)浪費(fèi)、保證發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量的關(guān)鍵因素。如圖3所示，發(fā)酵時(shí)間在24～60 h，枯草芽孢桿菌和黑曲霉快速繁殖，產(chǎn)生大量的蛋白酶，因此多肽得率和發(fā)酵體系蛋白酶活力都呈現(xiàn)上升的趨勢，在60 h達(dá)到最大。隨著時(shí)間的延長，微生物從穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，蛋白酶產(chǎn)量和活力降低，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷被利用，而菌種的生化反應(yīng)過程并未終止，可能積累其他影響發(fā)酵液質(zhì)量的有害代謝產(chǎn)物，微生物生長受到抑制[16]。還有可能隨著時(shí)間的增加，產(chǎn)生的多肽類會被進(jìn)一步水解成氨基酸，多肽得率有所下降[17]。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為48～72 h。

圖2 接種量對酶活力和多肽得率的影響
Fig.2 Effect of inoculation amount on enzyme activity and peptide yield

圖3 發(fā)酵時(shí)間對酶活力和多肽得率的影響
Fig.3 Effect of fermentation time on enzyme activity and peptide yield

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用軟件Design Expert 10建立3因素3水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以多肽得率(Y1)和酶活力(Y2)為考察指標(biāo)，選取復(fù)配比(A)、接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為響應(yīng)變量，每個(gè)因素設(shè)置低(-1)、中(0)、高(1)3個(gè)水平，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化枯草芽孢桿菌和黑曲霉復(fù)配發(fā)酵蜂王幼蟲工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表
Table 1 Response surface test factor level table

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型分析及優(yōu)化工藝條件確定與結(jié)果驗(yàn)證

利用Design-Expert 10.0統(tǒng)計(jì)軟件將多肽得率和酶活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行二次回歸擬合，并對二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行方差分析，所建立的模型能比較準(zhǔn)確地分析和預(yù)測蜂王幼蟲液態(tài)發(fā)酵條件與多肽得率及酶活力的關(guān)系，并對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，明確了3個(gè)因素對多肽得率和酶活力影響的主次順序。在此基礎(chǔ)上，得到枯草芽孢桿菌和黑曲霉復(fù)配發(fā)酵蜂王幼蟲制備活性肽的最佳工藝條件為：復(fù)配比2.426∶1，接種量6.512%，發(fā)酵時(shí)間57.553 h，在此發(fā)酵條件下，多肽得率和酶活力的理論值是15.624%和128.38 U/mL。為驗(yàn)證響應(yīng)面的可行性以及為方便操作，將發(fā)酵參數(shù)設(shè)為復(fù)配比2.4∶1，接種量6.5%，發(fā)酵時(shí)間57.5 h，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測得平均多肽得率為(15.494±0.153)%，酶活力為(133.55±1.694) U/mL，均與理論預(yù)測值接近，由此說明用響應(yīng)面回歸模型擬合良好，對最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化具有一定的實(shí)用指導(dǎo)意義。

2.3 蜂王幼蟲粗多肽的氨基酸測定

氨基酸組成是影響多肽抗氧化活性的重要因素之一[18]。采用氨基酸分析儀測定最優(yōu)條件下發(fā)酵后的蜂王幼蟲粗多肽凍干樣品，氨基酸組成結(jié)果如表3所示，發(fā)現(xiàn)含量最高的是谷氨酸，達(dá)到14.17%，其次是脯氨酸(11.13%)、天冬氨酸(10.09%)、賴氨酸(8.78%)以及亮氨酸(7.84%)?？寡趸被岬暮窟_(dá)到58.11%，疏水氨基酸為47.2%。有研究指出多肽序列碳端相鄰的氨基酸殘基為疏水性較低的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等)會提高多肽的抗氧化活性[19]，預(yù)示發(fā)酵得到的粗多肽樣品具有良好的抗氧化潛力。

表3 蜂王幼蟲粗多肽凍干粉氨基酸組成分析
Table 3 Analysis of amino acid composition of queen bee larvae crude peptides freeze-dried powder

注：*為必需氨基酸；抗氧化氨基酸包括：天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸；疏水氨基酸：脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸

2.4 超濾分離純化組分的抗氧化性分析

2.4.1 不同分子段蜂王幼蟲多肽DPPH自由基清除活性

由圖4可知，發(fā)酵液各組分對DPPH自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的線性量效關(guān)系。在相同濃度條件下，<1 kDa的組分表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除效果，并且與其他組分的抗氧化活性存在顯著性差異，其IC50為1.06 mg/mL，結(jié)果見表4。產(chǎn)生上述差異的原因可能由于分子質(zhì)量小的低聚肽對應(yīng)的空間位阻小，能夠更好地靠近DPPH自由基，并與之發(fā)生反應(yīng)[20]。雖然各組分對自由基清除率均低于抗壞血酸的清除能力，但有研究指出當(dāng)某種物質(zhì)的自由基清除率IC50值<10 mg/mL時(shí)，即可推斷其具備一定的抗氧化能力[21]。可見，本實(shí)驗(yàn)中獲得的蜂王幼蟲發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，而且優(yōu)于賈歌[2]制備的蜂王幼蟲酶解產(chǎn)物，其<1 kDa的組分DPPH自由基清除率的IC50值為21.86 mg/mL。

2.4.2 不同分子段蜂王幼蟲多肽ABTS陽離子自由基清除活性

由圖5可知，在含量為0.1～0.5 mg/mL時(shí)，各組分對ABTS陽離子自由基清除率均呈現(xiàn)一定的正向劑量效應(yīng)，其中，<1 kDa組分和1～3 kDa組分的IC50值無顯著性差異，但當(dāng)多肽質(zhì)量濃度>0.2 mg/mL時(shí)，<1 kDa組分在所有濃度都表現(xiàn)出最強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除能力，這可能是因?yàn)?lt;1 kDa的肽段含有較多的游離氨基酸作為額外的電子和質(zhì)子來源[22]。如表5所示，蜂王幼蟲發(fā)酵產(chǎn)物<1 kDa組分清除ABTS陽離子自由基的IC50值為0.165 mg/mL，優(yōu)于徐萍[9]制備的蜂蛹多肽(IC50=0.67 mg/mL)。

圖4 不同分子段蜂王幼蟲多肽DPPH自由基清除活性
Fig.4 DPPH radical scavenging activity of queen bee larvae polypeptides with different molecular weights

表4 不同分子段蜂王幼蟲多肽清除DPPH自由基的IC50值
Table 4 The IC50 value of DPPH radical scavenging activity from queen bee larvae polypeptides with different molecular weights

注：不同字母標(biāo)注表示在Duncan分析下存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖5 不同分子段蜂王幼蟲多肽ABTS陽離子自由基清除活性
Fig.5 ABTS cation radical scavenging activity of queen bee larvae polypeptides with different molecular weights

表5 不同分子段蜂王幼蟲多肽清除ABTS陽離子自由基的IC50值
Table 5 The IC50 value of ABTS cation radical scavenging activity from queen bee larvae polypeptides with different molecular weights

2.4.3 不同分子段蜂王幼蟲多肽還原力

當(dāng)樣品具有一定的抗氧化能力時(shí)，可將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成亞鐵形式，這種還原能力可以視為其具有潛在抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)[23]。如圖6所示，在質(zhì)量濃度均為2 mg/mL時(shí)，蜂王幼蟲發(fā)酵產(chǎn)物的還原能力隨不同分子段的大小而有所差異，分子質(zhì)量<1 kDa的組分還原力顯著高于其他超濾組分(P<0.05)。在本研究中，2 mg/mL的蜂王幼蟲<1 kDa 組分多肽測得的吸光值為0.389，還原力高于用酶解法制備的蜂蛹多肽[9]以及用枯草芽孢桿菌發(fā)酵虎斑烏賊得到的抗氧化肽[24]，說明蜂王幼蟲<<1 kDa 組分具有較好的還原能力。

圖6 不同分子段蜂王幼蟲多肽的還原力
Fig.6 The reducing power of queen bee larvae polypeptides with different molecular weights

2.5 蜂王幼蟲抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

采用LC-MS/MS對蜂王幼蟲發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng)組分F1進(jìn)行分離鑒定，用MASCOT軟件檢索多肽數(shù)據(jù)庫，比對得到9個(gè)可能的肽段，多肽序列結(jié)果如表6所示。這些肽均為六肽以上，最長為十一肽，分子質(zhì)量在600～1 100 Da。多肽的抗氧化性與其氨基酸序列與組成存在構(gòu)效關(guān)系，報(bào)道指出分子質(zhì)量在500～1 800 Da的低聚肽的抗氧化性強(qiáng)于母體蛋白質(zhì)和長鏈多肽[25]。此外，多肽的抗氧化活性很大程度上還取決于氨基酸的組成，依據(jù)氨基酸抗氧化活性的強(qiáng)弱可分為四類，強(qiáng)抗氧化活性氨基酸包括Tyr、Trp、Cys、Met和His，芳香族氨基酸Tyr和Trp是良好的氫供體從而捕獲自由基，Cys和Met的側(cè)鏈基團(tuán)分別含有1個(gè)巰基，具有供電子和供氫的能力，His側(cè)鏈上的咪唑基團(tuán)是決定其抗氧化能力的關(guān)鍵因素[26]。中等抗氧化活性氨基酸包括Leu、Pro、Phe和Val，在多肽的N端存在疏水氨基酸，能提高多肽在脂質(zhì)中的溶解性，促進(jìn)肽與脂相中的自由基發(fā)揮作用[27]；弱抗氧化活性氨基酸包括Asp和Glu，側(cè)鏈基團(tuán)可以螯合金屬離子。其余7種氨基酸，抗氧化性微弱或沒有抗氧化活性。

觀察表6的結(jié)果，所鑒定的肽段都包含疏水性氨基酸(包括Pro、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Gly)，其中7條多肽鏈含有至少1個(gè)強(qiáng)抗氧化氨基酸(Tyr、Trp、Cys、Met和His)。因此可推測蜂王幼蟲多肽的抗氧化活性與這些短肽鏈關(guān)系密切。然而，為確定這些多肽鏈?zhǔn)欠窬哂休^強(qiáng)的抗氧化活性，需進(jìn)一步研究探索。

表6 鑒定的可信度較高多肽序列
Table 6 Identified peptide sequences with high reliability

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到混菌發(fā)酵蜂王幼蟲最佳工藝為枯草芽孢桿菌與黑曲霉的復(fù)配比為2.4∶1，接種量6.5%，發(fā)酵時(shí)間57.5 h，該條件下多肽得率為15.49%，發(fā)酵體系中酶活力為133.55 U/mL。蜂王幼蟲粗多肽的抗氧化氨基酸達(dá)到58.11%，疏水氨基酸為47.2%，說明其具有很好的抗氧化潛力。經(jīng)超濾分離后<1 kDa的組分F1相較于其他組分有更好的抗氧化活性，DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率的IC50值分別為(1.06±0.01)、(0.165±0.004) mg/mL，鐵還原力OD700 = 0.389。通過LC-MS/MS對組分F1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，篩選得到9肽段，分子質(zhì)量在600～1 100 Da。研究結(jié)果為蜂王幼蟲的高值化利用開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。