頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)不同多效價(jià)復(fù)合配方栽培香菇子實(shí)體揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

香菇(Lentinus edodes)又名香覃、冬菇，分類(lèi)學(xué)地位為擔(dān)子菌亞門(mén)、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科，小香菇屬[1-2]。我國(guó)香菇資源豐富，并且已有800多年的人工栽培歷史，是世界上香菇生產(chǎn)第一大國(guó)[3]。隨著產(chǎn)業(yè)化栽培技術(shù)的迅速發(fā)展，香菇已成為世界上第二大食用菌栽培品種，其獨(dú)特的風(fēng)味和廣譜藥理作用使其被大量的食用[4]。風(fēng)味主要包含鮮味和香味兩方面，香菇的鮮味，主要是由于存在谷氨酸，天冬氨酸和5′-核苷酸，尤其是5′-GMP、5′-IMP、5′-AMP和5′-XMP等小分子物質(zhì)[5]。香味則大部分由醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、醚類(lèi)、烷烴類(lèi)和烯烴類(lèi)等7種揮發(fā)性物質(zhì)組成，其中醇類(lèi)包括揮發(fā)性八碳化合物如1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等是香菇最重要的香味物質(zhì)，典型的1-辛烯-3-醇具有濃郁的蘑菇特有風(fēng)味[6]。醚類(lèi)中含硫化合物如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚等也是香菇風(fēng)味的重要組成成分，通常能影響香菇的整體風(fēng)味[7]。此外，香菇的風(fēng)味在感官屬性和消費(fèi)者接受度方面起著重要作用[8]。然而，食品中香味物質(zhì)的含量非常低，一般在μg/L水平[9]，因此對(duì)分析和檢測(cè)技術(shù)要求較高。頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技術(shù)是經(jīng)過(guò)萃取、解析過(guò)程，再結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，利用固相萃取吸附幾何微區(qū)效應(yīng)的一種提取分離檢測(cè)技術(shù)，常用于檢測(cè)食品香氣或揮發(fā)性成分，并且在揮發(fā)性成分的分析和鑒定方面效果十分理想[10-11]。它集頂空固相微萃取、氣相色譜安全、準(zhǔn)確、分離能力強(qiáng)和質(zhì)譜鑒定物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)于一體[12]。

安龍縣是貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展示范縣，該縣通過(guò)發(fā)展現(xiàn)代山地農(nóng)業(yè)示范園區(qū)與易地扶貧搬遷相結(jié)合，致力于打造“中國(guó)最大優(yōu)質(zhì)夏菇生產(chǎn)基地”、“中國(guó)西南菌都”、“食用菌硅谷”和“中國(guó)香菇第一村”，以實(shí)現(xiàn)農(nóng)村貧困人口脫貧致富。但是，安龍縣食用菌產(chǎn)業(yè)在持續(xù)發(fā)展中存在著生產(chǎn)香菇品質(zhì)不高等問(wèn)題。培養(yǎng)料是生產(chǎn)香菇的物質(zhì)基礎(chǔ)，其對(duì)香菇的風(fēng)味品質(zhì)至關(guān)重要。菜籽餅營(yíng)養(yǎng)豐富，其中粗蛋白含量較高，氨基酸組成均衡，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，適量添加菜籽餅可以提高香菇的品質(zhì)和產(chǎn)量[13-14]。本研究對(duì)添加不同含量菜籽餅的多效價(jià)復(fù)合配方栽培的香菇，采用固相微萃取法提取其子實(shí)體中揮發(fā)性物質(zhì)，再用氣相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)分析，目的是為香菇品質(zhì)的提高提供理論支持，促進(jìn)該地區(qū)香菇產(chǎn)業(yè)鏈延伸和產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用香菇栽培種由貴州安慶菌農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海菁海儀器有限公司；HP6890/5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；手動(dòng)固相微萃取裝置、2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多效價(jià)復(fù)合配方香菇子實(shí)體栽培色譜條件

食用菌栽培基質(zhì)最重要的2種成分為碳元素和氮元素，其中碳氮比對(duì)子實(shí)體的生長(zhǎng)具有重要的調(diào)控作用[15]。食用菌對(duì)栽培料碳氮比的要求通常在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段, 即菌絲體生長(zhǎng)階段，要求氮含量偏高, 碳氮比一般以20∶1為佳；子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育階段，要求氮含量所占的比例偏低，碳氮比以30～40∶1較優(yōu)[16]。本實(shí)驗(yàn)以企業(yè)常規(guī)栽培配方(木屑78%、麩皮20%、石膏1%、糖1%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))為對(duì)照，設(shè)置添加不同比例含量的菜籽餅代替麥麩栽培香菇，共設(shè)置5個(gè)配方，代替比例及各配方組成和配比見(jiàn)表1，每個(gè)栽培配方設(shè)3次重復(fù)，生產(chǎn)方法采用香菇常規(guī)生產(chǎn)方法。

生產(chǎn)流程：

備料→配料→裝袋→滅菌→冷卻→接種→菌絲培養(yǎng)→脫袋排場(chǎng)→轉(zhuǎn)色管理→變溫催菇→出菇管理→采收

表1 多效價(jià)菌棒復(fù)合配方
Table 1 Compound formulas of multi-titer fungus sticks

1.3.2 檢測(cè)方法

提取方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g鮮香菇丁(去除菇柄)，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析7 min進(jìn)樣。

色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度：38 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升溫至176 ℃，以6 ℃/min升溫至260 ℃；載氣：He；流量：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(electron impact，EI)；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；倍增器電壓1 812 V；質(zhì)量掃描范圍29～500 u。

1.3.3 揮發(fā)性成分定性與定量方法

各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 2017和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，對(duì)揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)制表，SPSS 21.0對(duì)特征風(fēng)味成分進(jìn)行主成分分析和聚類(lèi)分析，Origin 2018用于圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定及在不同復(fù)合配方中的差異

由圖1、圖2可知，通過(guò)HS-SPME-GC-MS從6種不同復(fù)合配方栽培香菇子實(shí)體中共檢測(cè)出醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、醚類(lèi)、烷烴類(lèi)、烯烴類(lèi)等55種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中包括13種醇類(lèi)物質(zhì)、13種醛類(lèi)物質(zhì)、5種酮類(lèi)物質(zhì)、5種酯類(lèi)物質(zhì)、4種醚類(lèi)物質(zhì)、10種烷烴類(lèi)物質(zhì)、5種烯烴類(lèi)物質(zhì)。不同復(fù)合配方栽培香菇子實(shí)體中相對(duì)含量最高的風(fēng)味成分均為1-辛烯-3-醇，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。根據(jù)不同復(fù)合配方中對(duì)香菇風(fēng)味重要的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量相比較發(fā)現(xiàn)，由于菜籽餅營(yíng)養(yǎng)豐富，適量的添加可使香菇的風(fēng)味物質(zhì)增加，復(fù)合配方3和復(fù)合配方4中揮發(fā)性成分均多于50種，高于常規(guī)配方的48種風(fēng)味物質(zhì)。其中，復(fù)合配方3栽培香菇子實(shí)體的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量最高，并且對(duì)香菇風(fēng)味組成重要的醇類(lèi)和醛類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的含量也均為最高，分別為81.4%和2.2%。但菜籽餅含有硫甙、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，且其油性較大，會(huì)影響香菇菌絲對(duì)培養(yǎng)基養(yǎng)料及水分的吸收，不利于揮發(fā)性風(fēng)味成分的積累，復(fù)合配方1和復(fù)合配方2分別為40種和45種風(fēng)味物質(zhì)，重要的醇類(lèi)和醛類(lèi)物質(zhì)分別為63.3%、0.9%和65.8%、1.0%，均比其他復(fù)合配方及常規(guī)配方的含量低。復(fù)合配方5與常規(guī)配方較為接近，菜籽餅代替比例僅為2%，因此2個(gè)配方所生產(chǎn)香菇子實(shí)體的重要的醇類(lèi)和醛類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量也較為接近，分別為47種、72.4%、1.8%和48種、72.9%、1.5%，說(shuō)明菜籽餅添加量較少，對(duì)重要揮發(fā)性物質(zhì)的影響也較小。

香菇的揮發(fā)性物質(zhì)主要為八碳化合物和含硫化合物，其中，1-辛烯-3-醇是香菇最具代表性的八碳化合物，又稱(chēng)蘑菇醇；1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷，又稱(chēng)香菇精，是一種揮發(fā)性環(huán)狀含硫化合物，香菇香味的主要呈味成分之一，香味強(qiáng)烈并且特征性強(qiáng)[18]。各配方香菇1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量排序?yàn)椋号浞?>配方4>配方5>常規(guī)配方>配方2>配方1;1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對(duì)含量排序?yàn)椋号浞?>常規(guī)配方>配方5>配方3>配方1>配方4。配方3中1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量最高為59.1%，比常規(guī)配方提高了7.2%，但1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對(duì)含量為0.6%，比常規(guī)配方降低了11.5%；配方1和配方2中1-辛烯-3-醇的相對(duì)含量分別為52.0%、53.7%，均低于其他復(fù)合配方及常規(guī)配方，然而配方2中1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對(duì)含量最高為0.7%；配方4中1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的相對(duì)含量最低為0.3%，低于常規(guī)配方的54.1%。如圖3所示，綜合2種揮發(fā)性物質(zhì)的總含量來(lái)看，配方3揮發(fā)性物質(zhì)含量相對(duì)較高，說(shuō)明菜籽餅的替代比例為10%更利于香菇子實(shí)體風(fēng)味物質(zhì)的積累。

圖1 不同復(fù)合配方栽培香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分種類(lèi)及相對(duì)含量
Fig.1 Types and relative contents of volatile flavor components in Lentinus edodes cultivated with different compound formulations

圖2 不同復(fù)合配方栽培香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分比較
Fig.2 Comparison of volatile flavor components of Lentinus edodes
cultivated with different compound formulas

圖3 不同復(fù)合配方栽培香菇2種主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較
Fig.3 Comparison of two main volatile flavor compounds of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

2.2 不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分分析

成分分析是一種多元統(tǒng)計(jì)技術(shù)，將原始的相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為一組新的不相關(guān)變量，其目的是在降維空間中提取最大的數(shù)據(jù)方差，主成分分析累計(jì)貢獻(xiàn)率越大，越能反映樣品的信息[19-20]。本試驗(yàn)以6種不同復(fù)合配方香菇的7種關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行主成分分析，綜合評(píng)價(jià)不同復(fù)合配方香菇的風(fēng)味品質(zhì)差異[21-23]。

2.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分主成分評(píng)價(jià)模型的構(gòu)建

以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)7種風(fēng)味成分降維進(jìn)行主成分分析，得到各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率，如表2所示。選取前3個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.1%(>85%)，包含了不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分的絕大部分信息，符合主成分分析要求[24]。結(jié)合表3主成分特征向量與荷載矩陣可得，前3個(gè)主成分中，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為43.1%，決定第一主成分的主要是醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)及烷烴類(lèi)物質(zhì)。第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為24.2%，決定第二主成分的主要是醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)及烷烴類(lèi)物質(zhì)。第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為21.8%，決定第三主成分的主要是醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、醚類(lèi)、烷烴類(lèi)及烯烴類(lèi)物質(zhì)。此外，荷載還能反映各變量與主成分間的相關(guān)系數(shù)，且絕對(duì)值數(shù)值越大，相關(guān)性越強(qiáng)[25-26]。由于各主成分反映的變異信息存在重合性，因此結(jié)合各主成分間的變異信息與主成分間的相關(guān)性，將7類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的變異信息分為3組，第一主成分主要反映醇類(lèi)及醛類(lèi)物質(zhì)的變異信息，第二主成分主要反映酮類(lèi)、醚類(lèi)及烷烴類(lèi)物質(zhì)的變異信息，第三主成分主要反映酯類(lèi)及烯烴類(lèi)物質(zhì)的變異信息

表2 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率
Table 2 Eigenvalues, contribution rates and accumulative contribution rate of principal components

2.2.2 基于主成分評(píng)價(jià)模型的風(fēng)味品質(zhì)的比較

根據(jù)表2、表3，建立復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)模型，得出各主成分得分與各揮發(fā)性風(fēng)味成分間的線性關(guān)系式為[27-29]：

F1=0.300X1+0.274X2-0.123X3+0.208X4-0.219X5+0.187X6-0.159X7

F2=0.051X1+0.160X2+0.502X3-0.171X4+0.306X5+0.360X6-0.240X7

F3=0.228X1-0.154X2+0.182X3+0.470X4+0.225X5+0.148X6+0.502X7

表3 主成分的特征向量與載荷矩陣
Table 3 Principal component eigenvectors and loading matrix

可以利用前3個(gè)主成分新的綜合指標(biāo)來(lái)替代原始的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。以不同特征值的方差貢獻(xiàn)率βi (i=1，2，…，k)為加權(quán)系數(shù)，利用綜合評(píng)價(jià)函數(shù)F=β1F1+β2F2+…+βkFk，建立不同復(fù)合配方栽培香菇綜合風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)模型：F=0.430 92F1+0.241 84F2+0.218 35F3。其中F1為第一主成分得分，F(xiàn)2為第二主成分得分，F(xiàn)3為第三主成分得分，得分值越高，表示該主成分對(duì)不同復(fù)合配方栽培香菇的風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。根據(jù)不同復(fù)合配方栽培香菇的風(fēng)味評(píng)價(jià)綜合得分值見(jiàn)表4，該得分值可反映不同復(fù)合配方栽培香風(fēng)味品質(zhì)的差異。

表4 不同復(fù)合配方栽培香菇主成分綜合得分
Table 4 Comprehensive scores of principal components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

由表4可知，復(fù)合配方4栽培香菇的第一、第三主成分得分較其他復(fù)合配方和常規(guī)配方高，反映出醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)及烯烴類(lèi)物質(zhì)對(duì)該復(fù)合配方栽培香菇樣品的風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)較大；復(fù)合配方2栽培香菇的第二主成分得分最高，充分反映出酮類(lèi)、醚類(lèi)及烷烴類(lèi)物質(zhì)對(duì)該復(fù)合配方栽培香菇樣品的風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)較大。因此，復(fù)合配方4栽培香菇受醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)及烯烴類(lèi)物質(zhì)的影響較大，復(fù)合配方2栽培香菇受酮類(lèi)、醚類(lèi)及烷烴類(lèi)物質(zhì)的影響較大。6種不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)從高到低綜合排名依次為復(fù)合配方3(F=15.841)、復(fù)合配方4(F=15.831 0)、復(fù)合配方5(F=15.678 3)、常規(guī)配方(F=15.782 6)、復(fù)合配方2(F=14.971 8)、復(fù)合配方1(F=13.192 5)，表明在該主成分評(píng)價(jià)模型下，不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)差異明顯，且復(fù)合配方3栽培香菇風(fēng)味品質(zhì)最佳。

2.2 不同復(fù)合配方香菇揮發(fā)性風(fēng)味成分聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析是將樣品對(duì)象的集合分組為類(lèi)似的對(duì)象組的多個(gè)類(lèi)的分析過(guò)程。如圖4所示，在歐式距離為5時(shí)，將5種復(fù)合配方和常規(guī)配方分為三類(lèi)，各風(fēng)味成分相對(duì)含量詳見(jiàn)表5。復(fù)合配方1單獨(dú)組成第一聚類(lèi)，占總配方的16.67%，這一聚類(lèi)的主要特點(diǎn)是風(fēng)味品質(zhì)適中。復(fù)合配方2單獨(dú)組成第二聚類(lèi)，其主要特點(diǎn)是酮類(lèi)、醚類(lèi)和烯烴類(lèi)物質(zhì)含量較高。復(fù)合配方3、復(fù)合配方4、復(fù)合配方5和常規(guī)配方共同組成第三聚類(lèi)，占總配方的66.67%，這類(lèi)群的醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)和烷烴類(lèi)物質(zhì)含量較高。復(fù)合配方1和復(fù)合配方2中重要揮發(fā)性物質(zhì)低于其他配方，說(shuō)明菜籽餅添加量過(guò)多會(huì)影響醇類(lèi)和醛類(lèi)等重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的積累。

圖4 不同復(fù)合配方栽培香菇風(fēng)味成分系統(tǒng)聚類(lèi)分析
Fig.4 Systematic cluster analysis of the flavor components of Lentinus edodes cultivated with different compound formulas

表5 復(fù)合配方栽培香菇3個(gè)聚類(lèi)的7種風(fēng)味物質(zhì)平均值
Table 5 Average values of seven flavor substances in three clusters of Lentinus edodes cultivated with compound formulas

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)香菇子實(shí)體風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定出55種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，且各配方中1-辛烯-3-醇含量均最高，分別為52.0%、53.7%、59.1%、58.9%、58.2%和55.1%。不同比例的菜籽餅替代麩皮的多效價(jià)復(fù)合配方對(duì)栽培的香菇子實(shí)體風(fēng)味成分均有影響，綜合1-辛烯-3-醇和1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷的總含量來(lái)看，配方3揮發(fā)性物質(zhì)含量相對(duì)較高；主成分分析選出3個(gè)代表89.1%樣品信息的主成分來(lái)說(shuō)明樣品之間的差異，其中代替比例為10%、5%的多效價(jià)復(fù)合配方風(fēng)味成分種類(lèi)和含量比常規(guī)配方高；聚類(lèi)分析也發(fā)現(xiàn)配方1和配方2中醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)和烷烴類(lèi)物質(zhì)低于其他復(fù)合配方和常規(guī)配方。對(duì)于替代比例僅為2%的配方5，香菇子實(shí)體的重要揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量為47種和86.3%，與常規(guī)配方的48種和86.9%相接近。綜合比較后得出復(fù)合配方3整體風(fēng)味品質(zhì)最佳。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析比較不同多效價(jià)復(fù)合配方和常規(guī)配方栽培香菇子實(shí)體的風(fēng)味成分，為香菇栽培配方的改良和品質(zhì)的提高提供理論基礎(chǔ)，對(duì)安龍縣食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。