大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法快速測定四種果蔬中阿維菌素農(nóng)藥殘留

阿維菌素是目前農(nóng)業(yè)應(yīng)用較多的微生物源殺蟲、殺螨、殺菌劑的一種,屬于土壤微生物阿維鏈霉菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，近年來被大量用于農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中，是種植業(yè)害蟲防治體系中理想的生物農(nóng)藥[1-4]。然而，對于阿維菌素這類高毒農(nóng)藥，不合理的施藥行為會導(dǎo)致環(huán)境中的農(nóng)藥污染以及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，從而影響到人們的身體健康，甚至還可能會引起食物中毒現(xiàn)象[5-6]。因此，我國規(guī)定阿維菌素在番茄、韭菜、結(jié)球甘藍(lán)等蔬菜以及柑橘類等水果中的最大殘留量為0.010～0.50 mg/kg[7]。

在農(nóng)殘檢測中用于檢測蔬果中阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)方法雖多[8-10]，但標(biāo)準(zhǔn)方法的樣品前處理涉及到的步驟較為繁瑣，耗時較長，當(dāng)需要進行大量樣品檢測時，將加大檢測人員的任務(wù)量，影響檢測時效。根據(jù)目前研究趨勢，對阿維菌素的檢測方法主要有：高效液相色譜紫外檢測[11-12]、高效液相色譜熒光檢測[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測[15-16]。其中，紫外和熒光法檢出限欠佳，前處理復(fù)雜甚至需進行衍生。質(zhì)譜法分析時間長，且研究大多數(shù)圍繞電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源展開，方法檢出限高但不穩(wěn)定，結(jié)果易受提取樣品中鈉含量的影響，線性不佳，故普適性不高[17-18]。

在越來越注重食品安全的當(dāng)下，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)管力度在不斷加強，建立一種簡便、準(zhǔn)確、快速的檢測方法，以解決日常檢測多種農(nóng)藥殘留面臨的基質(zhì)干擾、檢測時效低等問題顯得極其重要。

前處理方法中，QuEChERS法高效便捷，適合大批量樣品的篩查，同時，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，與ESI接口相比，大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)接口的基質(zhì)效應(yīng)較小[19]。因此本研究將二者結(jié)合，建立了一種新的阿維菌素檢測方法。方法性能測試的結(jié)果顯示，該方法檢測穩(wěn)定性好、基質(zhì)效應(yīng)低、回收率精密度符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。因此，本方法是一種適用于日常大批量蔬果中阿維菌素快速定量檢測的方法，可滿足農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的快篩監(jiān)測的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室用番茄，結(jié)球甘藍(lán)，韭菜和橙子，是經(jīng)實驗檢測后得到的空白樣品，所選的樣品均經(jīng)勻漿機打漿裝瓶貼標(biāo)簽后冷凍于-18 ℃條件下，備用。

阿維菌素農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1 000 mg/L)，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢測中心；乙酸銨、甲酸(均為優(yōu)級純)，安譜科學(xué)儀器有限公司(上海)；固體氯化鈉(分析純)，西隴化工股份有限公司；甲醇、乙腈(均為4 L容量色譜純)，德國默克公司；實驗用水為實驗室自制超純水；丙基乙二胺(primary-secondary amine，PSA)粉(100 mg)，成分為N-丙基乙二胺固相吸附劑，美國安捷倫有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 5500型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(軟件為Analyst)，可根據(jù)檢測情況替換離子源，配有APCI等2種接口裝置，美國AB SCIEX公司；N-EVAP 112型氮吹儀，美國Organomation Associates公司；Elix5型純水機，美國Millipore公司；XH-B型旋渦混合儀，康健醫(yī)療器具有限公司；TG16G型臺式高速離心機，凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；BS200S-WEI型電子天平，德國Sartorius公司；AS30600BDT型超聲波清洗機，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；聚四氟乙烯濾膜(0.22 μm孔徑)、棕色液相小瓶(規(guī)格：2 mL)，安捷倫科技有限公司；HY-5型回旋式振蕩器，江蘇省金壇市宏華儀器廠；KS4000i型控溫?fù)u床，德國IKA公司；AUTO-HOMOGEZER型自動勻漿機，Hestix Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20 mg/L)：準(zhǔn)確移取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL于50.00 mL的容量瓶，使用甲醇(色譜純)定容，標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液保存于-18 ℃條件下，備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.080 mg/L)：準(zhǔn)確移取上述配制的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20 mg/L)0.10 mL于25.00 mL容量瓶中，使用配制的甲醇-水溶液(體積比1∶1)定容至刻度線，現(xiàn)配現(xiàn)用。

阿維菌素純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作曲線：使用移液管準(zhǔn)確移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20 mg/L)，使用配制的甲醇-水(體積比1∶1)溶液稀釋至0.012 5、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40 mg/L，放置于0～4 ℃環(huán)境下待測。

5 mmol/L乙酸銨(含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲酸)溶液：使用電子天平準(zhǔn)確稱取固體乙酸銨0.392 g，吸取0.50 mL甲酸溶液，加水稀釋至1 000 mL刻度，經(jīng)5 min超聲脫氣后作為樣品上機時的流動相使用。

1.3.2 樣品處理與凈化

參照以往改良的QuEChERS法[20]，將冷凍的空白樣品在常溫下進行解凍后，充分?jǐn)嚢杈鶆?。使用電子天平?zhǔn)確稱取各類果蔬樣品(10±0.1) g，置于50 mL 的尖底塑料離心管中，管中添加20 mL的乙腈，設(shè)置勻漿機轉(zhuǎn)速為12 000 r/min勻漿2 min后加入3 g氯化鈉，充分振蕩30 min，使氯化鈉混合溶解。將該塑料離心管置于10 000 r/min高速離心機中離心3 min后，準(zhǔn)確移取2 mL上清液于15 mL塑料離心管中，添加100 mg PSA粉充分混合凈化1 min后，在轉(zhuǎn)速為9 000 r/min的高速離心機上離心1 min。

移取上清液1 mL于氮吹儀上50 ℃條件下緩緩吹至近干，得到各類樣品基質(zhì)。整個實驗檢測過程中嚴(yán)格控制樣品瓶保存溫度為4 ℃，以此減少樣品瓶中溶劑的揮發(fā)。

1.3.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將選定的4種樣品按1.3.2的方法處理后，得到4種空白基質(zhì)。分別用1.3.1所配制的系列純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作液定容至2.00 mL，依次配制得到0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將以上系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)孔徑0.22 μm的有機濾膜過濾至2 mL容量的液相小瓶中，按照設(shè)定的儀器條件上機測定，以待測阿維菌素的峰面積作為縱坐標(biāo)，選擇相對應(yīng)的添加濃度作為橫坐標(biāo)，以此繪制阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 檢測方法的穩(wěn)定性

將1.3.1配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.080 mg/L)在APCI模式下按照標(biāo)準(zhǔn)工作液、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的順序進樣，考慮該模式下的掃描時間，每間隔1 h對阿維菌素檢測方法穩(wěn)定性進行考察。

其中統(tǒng)計每間隔時間點連續(xù)進樣2次的平均峰面積[20]，某時間段的穩(wěn)定性計算如公式(1)所示：

某時間段的穩(wěn)定性/%

(1)

1.3.5 方法的正確度及精密度

結(jié)合回收率研究正確度，分別將番茄、結(jié)球甘藍(lán)、韭菜和橙子空白樣品進行添加回收實驗，考察檢測方法的正確度和精密度。準(zhǔn)確稱取4種空白基質(zhì)10 g(精確到0.001 g)至50 mL塑料離心管中，分成5個平行樣，分別添加標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20 mg/L)0.050、0.100 mL，即添加水平為0.1、0.2 mg/kg，混勻后同1.3.2節(jié)方法進行樣品處理后，甲醇-水(體積比1∶1)定容2.00 mL，過膜上機，計算上機所測定的加標(biāo)回收數(shù)據(jù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫設(shè)置：40 ℃；進樣量：10 μL；設(shè)定流速：0.60 mL/min；流動相管路A：水，流動相管路B：甲醇(色譜純)；流動相梯度洗脫程序：0～1.5 min 20%B逐漸升至50%B；1.5～4.5 min 95%B；4.5～4.6 min 95%B逐漸下降至20%B；4.5～6.5 min 20%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子監(jiān)測模式：APCI-；氣簾氣：40 psi；碰撞氣壓力：8 psi；離子化電壓：-4 500 V；源溫：550 ℃；噴霧氣：55 psi。

質(zhì)譜檢測參數(shù)詳見表1。

表1 阿維菌素液質(zhì)質(zhì)多離子掃描檢測參數(shù)(APCI)
Table 1 The LC-MS-MS multiple reaction monitoring parameters of avermectin(APCI)

注：*定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的檢測穩(wěn)定性

為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，考察方法檢測過程中的穩(wěn)定性是確證方法的必要指標(biāo)。在以往檢測中，多采用甲醇、乙腈、乙腈-水和甲醇-水作為定容溶劑上機，但是研究表明，定容體系中使用甲醇-水(1∶1，體積比)時可以在長時間(11 h)的檢測中展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性[21]。故本文采用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水進行置換溶劑再上機，以減少溶劑因素對檢測穩(wěn)定性的影響。

由圖1可知，按1.3.1處理的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在APCI上每隔1 h檢測的前后2次峰面積的比值均在5%以下。這表明，阿維菌素在該方法上呈現(xiàn)出的穩(wěn)定性高。

圖1 APCI模式下阿維菌素檢測穩(wěn)定性(5 h內(nèi))
Fig.1 The stability of avermectin detection under APCI mode (in 5 h)

2.2 方法的線性方程及基質(zhì)效應(yīng)

本文測定過程前處理上選擇采用分散固相萃取，為了避免儀器檢測時引入更多基質(zhì)，對樣品進行稀釋后上機，以降低基質(zhì)帶來的影響。

由表2可知,按照1.3.3方法處理，在空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相應(yīng)的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線0.012 5～0.40 mg/L，4種基質(zhì)添加阿維菌素質(zhì)量濃度與對應(yīng)的峰面積間的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

本文參考國內(nèi)外研究中表示基質(zhì)效應(yīng)的方法，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線及斜率比值法評價阿維菌素在各樣品上的基質(zhì)效應(yīng)[22-25]。當(dāng)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與各基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值為1.0±0.2時，表示所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)[26]。其中斜率比值越趨向1.0，表示所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)越??；當(dāng)比值大于1.0時，表示基質(zhì)有增強作用；而比值小于這個范圍時，則表示基質(zhì)產(chǎn)生了抑制作用。

結(jié)果如表2所示，4種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)在0.97～1.05，這意味著基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計，同時解決了以往研究中檢測阿維菌素的絕對基質(zhì)效應(yīng)低的問題[20]。因此，在此方法上不同的果蔬樣品產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)總體較弱，影響較小，幾乎可以用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液直接進行測定。

表2 APCI上阿維菌素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)(線性范圍：0.012 5～0.40 mg/L)
Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and matrix effects of avermectin on APCI (0.012 5-0.40 mg/L)

注：“-”表示無

2.3 四種基質(zhì)在APCI中的添加回收試驗

由表3可知，在0.01、0.1、0.2 mg/kg 3水平加標(biāo)回收試驗中，4種基質(zhì)中添加的阿維菌素平均回收率均為93.3%～100.8%，得到RSD為1.8%～5.7%。通過分析各基質(zhì)中阿維菌素的結(jié)果可知，該方法檢測阿維菌素精密度高，回收率理想且穩(wěn)定，滿足阿維菌素農(nóng)藥殘留分析測試的要求[27-28]。

3 結(jié)論

本文對測定果蔬中阿維菌素的大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法結(jié)合改良的樣品前處理法(QuEChERS-LC-APCI-MS-MS)進行了可行性的研究，同時考察了檢測過程中的穩(wěn)定性、基質(zhì)效應(yīng)以及方法準(zhǔn)確度等指標(biāo)。結(jié)果表明，該方法在4種基質(zhì)中添加3水平加標(biāo)回收試驗中，精密度高(1.8%～5.7%)，回收率穩(wěn)定(93.3%～100.8%)，且5 h內(nèi)檢測阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性良好(比值<5%)，以及在0.012 5～0.40 mg/L 表現(xiàn)出理想的線性關(guān)系(r2≥0.99)，幾乎不存在基質(zhì)效應(yīng)(斜率比：0.97～1.05)，這意味著，在茄果、蕓薹屬、鱗莖和柑橘類四類農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素殘留檢測過程中可省略相應(yīng)基質(zhì)配標(biāo)的步驟，直接使用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進行定量。由于實驗測算整個檢測過程僅需0.48 h，還可同一時間處理多個樣品進行檢測。綜上所述，該方法操作簡便，基質(zhì)影響小，方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確快捷，不失為一種大批量農(nóng)產(chǎn)品中阿維菌素的理想初篩方法。但是，本實驗只進行了4種果蔬基質(zhì)中阿維菌素的方法性能指標(biāo)的研究，考慮到農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)類型的復(fù)雜性，本研究后續(xù)將對其他基質(zhì)的結(jié)果進行驗證，以考察方法的適用性范圍。同時由于APCI接口有適合分析中等極性到弱極性化合物的特性，該方法能否作為多種農(nóng)藥的理想篩查方法還有待研究。

表3 阿維菌素在APCI中4種基質(zhì)的添加回收率和RSD(n=5)

Table 3 Recoveries and RSDs of avermectin in four matrices at three spiked levels in APCI (n=5)