脂肪酶催化制備長短鏈甘油三酯的工藝研究

肥胖已成為世界范圍內(nèi)的首要健康問題，是導(dǎo)致幾種慢性疾病的危險因素。能量攝入和能量消耗之間不平衡導(dǎo)致人體內(nèi)的脂肪不斷堆積，越來越多的人通過以低熱量脂肪替代傳統(tǒng)膳食脂肪來降低對高熱量的攝入。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是一類由傳統(tǒng)油脂改性而成的低熱量油脂，具有特殊的脂肪酸組成和位置分布，能夠在提供人體所必須的營養(yǎng)的同時，很好地降低熱量。

長短鏈甘油三酯（Salatrim）以短鏈脂肪酸為酰基供體，易于吸收，不易堆積，是一種能代替普通油脂為人體供能的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。目前，國內(nèi)外關(guān)于長短鏈甘油三酯的合成研究已不在少數(shù)。張晶等以三乙酸甘油酯和三油酸甘油酯在Lipozyme TL IM催化作用下，酯交換合成SLCTs，經(jīng)優(yōu)化條件實驗后，長短鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)酯的產(chǎn)率達到76%。Cao等則利用茶籽油脂肪酸甲酯與三乙酸甘油酯進行酯交換反應(yīng)，制備的 SLCTs 具有降低餐后血脂的功能。

丁酸（Butyrate acid，BA），俗稱酪酸，是構(gòu)成脂肪的一種脂肪酸，含有4個碳原子的短鏈飽和脂肪酸。丁酸對結(jié)腸壁細胞有多重保護作用，并可以延伸到結(jié)腸外，減少脂肪堆積、控制脂肪肝、降低血糖，對人體和大腦都有的健康作用。隨著年齡的增長，人體內(nèi)的腸道微生物大量減少，微生物發(fā)酵生成的丁酸不能滿足腸道細胞的需要，腸道老化現(xiàn)象嚴重，這時補充外源性丁酸將有助于人體機能提升。多數(shù)研究以三丁酸甘油酯為原料，通過與天然油脂或脂肪酸甲酯酯交換制得長短鏈甘油三酯，或者直接以丁酸酸解催化油脂制得產(chǎn)物。如Han等用Lipozyme RM IM催化三丁酸甘油酯和硬脂酸甲酯的酯交換反應(yīng)合成一種低熱量的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。目標產(chǎn)品在最佳條件下經(jīng)短程分子蒸餾后所顯示的固體脂肪含量值類似于可可脂替代品、可可脂當量和可可脂，表明其應(yīng)用于與其他脂肪包合作為可可脂替代品。Tsuzuki等研究了不同脂肪酶在有機溶劑體系下催化短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸，與三油酸甘油酯進行酸解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)丁酸更易插入三油酸甘油三酯中替代油酸。當前關(guān)于以丁酸乙酯為原料，通過酯交換制得長短鏈甘油三酯的工藝未見有報道。

本研究旨在在無溶劑介質(zhì)中，通過脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交換反應(yīng)，以丁酸插入率為指標，探究合成長短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)條件。本文在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上豐富了國內(nèi)對大豆油改性制備低熱量結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的全面研究，進而促進了社會發(fā)展。

一、材料與方法

1.實驗材料

大豆油（浙江益海嘉里食品工業(yè)有限公司）；丁酸乙酯（純度＞98%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；固體脂肪酶Novozyme 435（諾維信生物技術(shù)有限公司）；丁酸甲酯（上海Merck公司）；正己烷及其他有機試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司）；氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；BS224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；離心機（常州國華電器有限公司）。

2.實驗方法

（1）長短鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離。制備：大豆油與丁酸乙酯的酯交換反應(yīng)在無溶劑體系中進行，稱取15g的大豆油與一定量的丁酸乙酯置與150mL的錐形瓶內(nèi)，混合均勻，并加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435，蓋緊塞子，將其放在恒溫水浴振蕩器中，保持100r/min的振蕩速率，在特定溫度下反應(yīng)4h后終止，過濾除去固體脂肪酶。

薄層層析法分離：選用100mm×200mm規(guī)格的硅膠板，對丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油與丁酸乙酯合成的長短鏈甘油三酯產(chǎn)物進行TLC分析，參照標準譜圖將對應(yīng)的長短鏈甘油三酯條帶刮下，用正己烷萃取2次，加入適量的無水硫酸鈉，然后旋蒸除去正己烷。

（2）產(chǎn)物組成分析。采用氣相色譜檢測方法：稱取0.1g樣品，溶于10mL正己烷中，混合均勻后取1mL置于色譜瓶中進行氣相分析。

氣相色譜條件：色譜柱DB-1HT 毛細血管（29m×250μm×0.2μm）；載氣N₂（純度99.999%）；進樣量1，進樣口溫度260℃，分流比20∶1；氫火焰離子化檢測器，檢測口溫度380℃；氫氣流量60mL/min，空氣流量400L/min，尾吹氣流量50mL/min。程序升溫條件：溫度80℃，保持2min；然后以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至200℃，保持1min；再以30℃/min的升溫速率加熱至350℃，保持6min。

（3）脂肪酸組成分析。甲酯化方法：稱取100mg分離后的產(chǎn)物，加入2mL 0.2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液快速混勻，再移取3mL的正己烷震蕩30s，使之充分混合后，放入離心機離心2min，獲得分層溶液，將上層透明澄清溶液用無水硫酸鈉干燥，然后吸取上清液用于氣相分析。

二、結(jié)果與討論

1.產(chǎn)物組成分析。

產(chǎn)物甲酯化后的氣相色譜圖，對照各標準樣品對產(chǎn)物譜圖進行定性分析，丁酸甲酯保留時間2.119min，棕櫚酸甲酯保留時間15.176min，硬脂酸甲酯保留時間16.642min，油酸甲酯保留時間16.905min，亞油酸甲酯保留時間17.383min，亞麻酸甲酯保留時間17.887min。根據(jù)圖中數(shù)據(jù)可以看出，在本實驗選定的反應(yīng)條件下，圖中未出現(xiàn)太多雜峰，且各脂肪酸甲酯的分離情況較好。

2.單因素實驗結(jié)果分析。（1）反應(yīng)時間對產(chǎn)物中長短鏈甘油三酯的影響。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比3∶1、反應(yīng)溫度50 ℃、加酶量為總底物的9%時，每次間隔2h進行一次產(chǎn)物取樣，以探究制備長短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)時間。

在不同反應(yīng)時間下進行長短鏈甘油三酯的制備，丁酸的插入率發(fā)生了改變。在開始反應(yīng)的10h內(nèi)，隨著時間的推移，反應(yīng)速度加快，丁酸的插入率持續(xù)提升；在反應(yīng)了10h時，丁酸的插入率已經(jīng)達到了12.16%；而在反應(yīng)了10h之后，丁酸的插入率反而下降了。這是因為酯交換反應(yīng)是一個對峙反應(yīng)，也可以用化學(xué)動力學(xué)平衡理論對這種現(xiàn)象進行解釋。在反應(yīng)早期，正向反應(yīng)的速率快于反向反應(yīng)的速率，因此丁酸插入率會不斷增加。但是，隨著反應(yīng)的進行，反向反應(yīng)的速率逐漸增加，正向反應(yīng)的速率逐漸降低，最終達到動態(tài)平衡，這時反應(yīng)的產(chǎn)物和反應(yīng)物濃度不再發(fā)生變化，所以插入率也不再增加。而隨著時間的推移，由于反向反應(yīng)速率增加，丁酸插入率反而會下降。綜合考慮，反應(yīng)進行10h為最佳。在本實驗的后續(xù)階段將會把反應(yīng)10h時的數(shù)據(jù)作為主要數(shù)據(jù)。

（2）加酶量對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1、反應(yīng)溫度為50℃的反應(yīng)條件下，探究不同反應(yīng)溫度對制備長短鏈甘油三酯的影響。

在加酶量為3%～9%時，丁酸插入率隨著加酶量的增加而增加，但在加酶量超過9%后，丁酸插入率反而隨著加酶量的提升而降低。在反應(yīng)初期，較高的加酶量會促進酶活性位點，提高反應(yīng)速率，導(dǎo)致?；w的摻入量增加。同時這一時期，底物分子與酶分子的結(jié)合比較容易，酶底物復(fù)合物的形成速率較快，這就使得丁酸插入率隨著加酶量的增加而提升。但當加酶量超過一定閾值時，丁酸插入率反而會隨著加酶量的增加而降低，這是因為隨著反應(yīng)的進行，脂肪酶產(chǎn)生聚集，致使底物難以擴散，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。為了降低生產(chǎn)成本并提高反應(yīng)效率，加酶量控制在9%為最佳。

（3）反應(yīng)溫度對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1、加酶量為總底物9%時，探究不同反應(yīng)溫度對制備長短鏈甘油三酯的影響。

在反應(yīng)溫度為40～60℃時，丁酸插入率顯著提升，根據(jù)Arrhenius定律，反應(yīng)溫度的升高通常導(dǎo)致由酶催化的加速效應(yīng)。由于熱力學(xué)平衡的移動，高溫有利于反應(yīng)正向移動，同時較高的溫度降低了溶液的粘度，減少了傳質(zhì)限制，此時底物分子與酶分子之間的相互作用增強，酶與底物的結(jié)合力增加，使得酶底物復(fù)合物的形成速率提高。然而，當反應(yīng)溫度超過一定閾值時，酶會發(fā)生構(gòu)象變化，酶分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變，酶的催化活性會受到影響；同時，溫度升高也會加速酶的失活，降低酶的穩(wěn)定性，使酶分子失去原有的催化能力，從而導(dǎo)致丁酸插入率開始降低。

（4）丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對長短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時間為10h、反應(yīng)溫度為60℃、加酶量為總底物的9%的反應(yīng)條件下，探究丁酸乙酯與大豆油的不同摩爾比對制備長短鏈甘油三酯的影響。

酯交換反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，反應(yīng)平衡是一個動態(tài)過程，這種平衡僅與起始反應(yīng)物的濃度相關(guān)，即丁酸乙酯與大豆油的摩爾比。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1∶1至3∶1的范圍內(nèi)時，隨著底物中丁酸的量不斷上升，丁酸的插入率得到了顯著提升；但是在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比達到3∶1之后，丁酸插入率轉(zhuǎn)為下降。這是因為在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1∶1至3∶1的范圍內(nèi)時，丁酸量的增加可以提高丁酸在化學(xué)反應(yīng)中的濃度，從而促進丁酸的插入率。但當丁酸乙酯與大豆油的摩爾比超過3∶1時，丁酸乙酯的濃度占據(jù)了主導(dǎo)地位，丁酸的濃度相對降低，從而導(dǎo)致丁酸的插入率下降。綜合考慮，選擇丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1最合適。

三、結(jié)論

以丁酸乙酯和大豆油為原料，固體脂肪酶Novozyme 435為催化劑，探究了反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、加酶量和底物比率對大豆油中丁酸插入率的影響。探究結(jié)果表明：在反應(yīng)時間為10h、反應(yīng)溫度為50℃、加酶量為9%、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3∶1時，大豆油中丁酸的插入率最高。

文章來源：  《中國食品》  http://12-baidu.cn/w/qt/29400.html