Microbacterium sp.XT11黃原膠內(nèi)切酶在畢赤酵母中的異源表達、性質(zhì)及應用

黃原膠是由野油菜黃單孢菌分泌的一種胞外雜多糖，主鏈由以β-1,4糖苷鍵相連的葡萄糖構成，甘露糖→葡萄糖→甘露糖組成其側鏈，分子質(zhì)量一般為2×106～5×107 Da[1]。研究發(fā)現(xiàn)，由黃原膠降解而來的低分子質(zhì)量黃原膠可以抑制軟骨細胞凋亡[2]、治療骨關節(jié)炎[3]，還具有抗氧化活性[4]、抑菌[5]、清除自由基[6]等功效，具有較高的市場價值。因此，通過降解黃原膠生產(chǎn)低分子質(zhì)量黃原膠具有重要的意義。

常見的多糖降解方法有物理法，化學法和生物酶法[7]。相對于物理法和化學法，生物酶法反應條件溫和、過程可控，因而被廣泛應用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，與黃原膠降解直接相關的酶有黃原膠內(nèi)切酶、β-D-葡萄糖苷酶，黃原膠裂解酶、α-D-甘露糖苷酶、不飽和葡萄糖醛酸酶，其中黃原膠內(nèi)切酶是一種能隨機切割黃原膠主鏈的β-1,4-葡萄糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶，對黃原膠的降解起關鍵性作用[9]。LI等[10]對來自Microbacterium sp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶進行了研究，發(fā)現(xiàn)其能直接作用于黃原膠主鏈使其降解。YANG等[11]將此黃原膠內(nèi)切酶在大腸桿菌中胞內(nèi)表達，對其結構進一步研究，發(fā)現(xiàn)它具有一般的內(nèi)切葡聚糖酶具有的2個典型的結構域：具有催化活性的催化結構域和只具有結合功能但無催化活性的碳水化合物結合模塊，推測其可能是來自GH9 家族的新分支。但是大腸桿菌的胞內(nèi)表達和較低的酶活力限制了大規(guī)模應用。

畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種成熟的蛋白表達宿主，在畢赤酵母中胞外表達的酶具有更高的生產(chǎn)率和純度，操作相對比較簡單且成本較低，主要用于生物制藥和工業(yè)酶的生產(chǎn)[12-13]。合適的啟動子能使外源蛋白高效表達，畢赤酵母的啟動子分為誘導型啟動子和組成型啟動子，其中AOX1和GAP最為常用[14]。

本研究首次將來自Microbacterium sp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶，以畢赤酵母GS115為表達宿主進行異源表達。并對其啟動子及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，對重組黃原膠內(nèi)切酶的酶學性質(zhì)做了初步探索，并利用其對黃原膠進行水解，為低分子質(zhì)量黃原膠的制備提供了一個可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌JM109和畢赤酵母GS115均為本實驗室保藏；載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：5酵母膏，10胰蛋白胨，5 NaCl，20瓊脂粉(固體培養(yǎng)基)，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，15 min)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，20葡萄糖，20瓊脂粉(固體培養(yǎng)基)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，13.4YNB，4×10-4生物素，10甘油，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：10酵母膏，20蛋白胨，13.4 YNB，4×10-4生物素，5甲醇，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)。

BSM培養(yǎng)基：26.7 mL/L 85% H3PO4，0.93 g/L CaSO4，18.2 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，40 g/L甘油，4.35 mL/L PMT1。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoR I、Not I、Sac I、Sal I、BamH I)、DNA膠回收試劑盒，美國Thermo公司;Taq Premix、DNA Maker、DNA連接酶(Solution I)，TaKaRa公司(大連);Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、氨芐青霉素、遺傳霉素(G418)、瓊脂糖，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 儀器與設備

C1000 TouchTM型 PCR儀、Micro PulserTM型電轉儀，美國Bio-Rad公司；KTA蛋白純化系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司；TU-1810分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構建

黃原膠內(nèi)切酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以CGGAATTCATGTCTAGACGTAGAGCCTCTTC(EcoR I)為上游引物，TAAAGCGGCCGCTTAACCAACGGCCACACCAGTAAC(Not I)為下游引物，經(jīng)PCR擴增后通過雙酶切法插入到畢赤酵母表達質(zhì)粒pPIC9K中組成重組質(zhì)粒pPIC9K-EX。將重組質(zhì)粒pPIC9K-EX轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞后涂布于帶有Amp抗性的LB平板上，挑取陽性轉化子進行菌落PCR, 質(zhì)粒酶切，測序驗證。

在此基礎上，以畢赤酵母GS115基因組為模板，GCAGCGAGCTCAATGTCTTGGTGTCCTCGTC(Sac I)為上游引物，GGCCGGATCCATTTAAAGTCTTTGGGTCAGG(BamH I)為下游引物，經(jīng)PCR擴增后得到GAP基因片段，再通過雙酶切法替換重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的啟動子AOX1片段組成重組質(zhì)粒pGAP9K-EX(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒構建示意圖
Fig.1 Construction of plasmids pPIC9K-EX and pGAP9K-EX

1.2.2 黃原膠內(nèi)切酶的表達與篩選

將驗證成功的質(zhì)粒pPIC9K-EX，pGAP9K-EX分別線性化(Sal I)后電轉入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)過MD，G418板篩選后[15]，分別挑取20株陽性轉化子提取基因組進行PCR驗證。將驗證成功的陽性轉化子分別進行搖瓶發(fā)酵，測定其酶活力，以篩選高酶活力菌株。

1.2.3 重組酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化

將重組畢赤酵母在YPD平板上30 ℃下活化60～72 h，挑取單菌落接種至25 mL YPD培養(yǎng)基中，以200 r/min、30 ℃下培養(yǎng)16～18 h獲得種子液(OD600=2～6)。設置初始發(fā)酵條件：pH 6.0；接種量5%(相對于培養(yǎng)基)；溫度30 ℃；轉速：200 r/min。對培養(yǎng)溫度、pH、轉速和接種量進行優(yōu)化，發(fā)酵結束后測定其細胞干重、酶活力。

1.2.4 7-L發(fā)酵罐放大生產(chǎn)黃原膠內(nèi)切酶

將重組畢赤酵母7-L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)。選用BMS培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始裝液量3.0 L，接種量為5%，待出現(xiàn)溶氧反彈之后補加甘油，同時調(diào)節(jié)通氣量和轉速，使溶氧保持在20%左右。每隔4～6 h取1次樣，測定其細胞干重、蛋白濃度及黃原膠內(nèi)切酶酶活力。

1.2.5 黃原膠內(nèi)切酶的分離純化

采用離心、硫酸銨沉淀等步驟對發(fā)酵液進行初步純化。發(fā)酵液8 000 r/min離心 5 min，得到上清液；加入硫酸銨，攪拌溶解后使硫酸銨終質(zhì)量濃度為400 g/mL，在4 ℃下放置過夜，并于12 000 r/min、4 ℃ 條件下離心15 min 收集蛋白沉淀。最后，采用KTA Avant蛋白純化系統(tǒng)，將粗酶液進行體積排阻層析(Superdex G100)進行分離，用SDS-PAGE分析純化后的酶。

1.2.6 黃原膠內(nèi)切酶活力和蛋白濃度的測定

酶反應體系(5 mL)為2 g/L 黃原膠，10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)，適量酶液。于40 ℃下反，10 min，沸水浴10 min 終止反應，DNS法測定反應體系中還原糖濃度[16]，空白為滅活的酶液。酶活定義：每分鐘釋放1 μmol/L 還原糖所需的黃原膠內(nèi)切酶酶量為1 U。利用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度[16]。

1.2.7 黃原膠內(nèi)切酶酶學性質(zhì)研究

為測定黃原膠內(nèi)切酶的最適pH，用10 mmol/L 不同pH(3.0～9.0)的磷酸鈉緩沖液測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算各pH下的相對酶活力。測定pH穩(wěn)定性時，用上述緩沖液稀釋酶液，并在4 ℃ 下放置3 h，按標準方法測定酶活力，以未經(jīng)處理的黃原膠內(nèi)切酶酶液為100%，計算各pH下的殘余酶活力。為測定重組黃原膠內(nèi)切酶最適溫度，在20～70 ℃ 測定黃原膠內(nèi)切酶酶活力，以最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。測定溫度穩(wěn)定性時，將適當稀釋后的酶液于20～70 ℃ 保溫3 h后測定酶活力，以未經(jīng)處理的黃原膠內(nèi)切酶酶液為100%，計算各溫度下的殘余酶活力。

1.2.8 低分子質(zhì)量黃原膠的制備

將2 g/L 原膠溶解于10 mmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)中，加入足量的黃原膠內(nèi)切酶，40 ℃ 反應5 h，水解產(chǎn)物經(jīng)Sevage法[17]除蛋白，加入一定體積的無水乙醇醇沉，得到水解產(chǎn)物。采用高效體積排阻色譜(high-performance size exclusion chromatograph，HPSEC)測定其分子質(zhì)量。

2 結果與分析

2.1 黃原膠內(nèi)切酶的表達與純化

Microbacterium sp.XT11來源的黃原膠內(nèi)切酶基因(EX, GenBank：ALX66163.1)全長2 856 bp，編碼951個氨基酸，針對畢赤酵母偏好性，對黃原膠內(nèi)切酶基因進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后密碼子的適應指數(shù)從0.49升到0.88，平均GC含量(DNA 4種堿基中，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率)從67.3%調(diào)整至44.3%，并避免了EcoR I、Not I、Sac I、Sal I、BamH I等常用酶切位點。

重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的驗證結果如圖2-a所示，其單酶切結果與重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的大小相符，雙酶切及PCR結果均在2 800 bp左右出現(xiàn)明顯條帶，與黃原膠內(nèi)切酶基因大小一致，隨后的測序驗證表明重組質(zhì)粒pPIC9K-EX構建成功。以同樣的方法驗證重組質(zhì)粒pGAP9K-EX(圖2-b)，最后的測序驗證表明重組質(zhì)粒pGAP9K-EX構建成功。將驗證成功的重組質(zhì)粒pPIC9K-EX、pGAP9K-EX分別線性化后導入畢赤酵母感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選最終得到16株重組畢赤酵母-pPIC9K-EX和15株重組畢赤酵母pGAP9K-EX。將重組畢赤酵母搖瓶發(fā)酵后測定其酶活力，由圖2-c可以看出，以AOX1為啟動子的重組畢赤酵母酶活力最高為240.12 U/L(A8)，以GAP為啟動子的重組畢赤酵母(圖2-d)酶活力最高為300.23 U/L(G12)。

ExPASy預測黃原膠內(nèi)切酶分子質(zhì)量約為101 kDa。發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結果(圖3-a)顯示，泳道2(A8)和泳道4(G12)均在95～130 kDa有明顯的條帶，表明重組畢赤酵母-pPIC9K-EX、重組畢赤酵母-pGAP9K-EX均可成功的表達黃原膠內(nèi)切酶。圖3-b中無明顯雜帶，表明雜蛋白已被去除。對于畢赤酵母表達系統(tǒng)而言，不同啟動子的表達速率和表達條件均有很大差異，當啟動子為AOX1時，需要甲醇誘導才能表達外源蛋白；當啟動子為GAP時，表達外源蛋白無需誘導[14]。高酶活力菌株重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12表達黃原膠內(nèi)切酶的水平(300.23 U/L)高于重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8(240.12 U/L)，且培養(yǎng)條件、發(fā)酵調(diào)控相對比較簡單，所以選用重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12做后續(xù)研究。

M-DNA Marker；1、2-EcoR I、Not I單酶切結果；3-雙酶切結果；4-EX基因PCR結果；5、6-Sac I、BamH I單酶切結果；7-雙酶切結果；
8-GAP基因PCR結果；9-四酶切結果
a-重組質(zhì)粒pPIC9K-EX的驗證；b-重組質(zhì)粒pGAP9K-EX的驗證；c-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX高酶活力篩選；
d-重組畢赤酵母酵母-pGAP9K-EX高酶活力篩選
圖2 重組酵母的構建與篩選
Fig.2 Construction and screening of recombinant Pichia pastoris

M-蛋白質(zhì)Marker；1、3-原始畢赤酵母；
2-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8；4-重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12；
5-重組畢赤酵母-pPIC9K-EX-8；
6-重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12
a-重組畢赤酵母發(fā)酵上清液；b-純化后
圖3 SDS-PAGE檢測重組黃原膠內(nèi)切酶的表達和純化
Fig.3 SDS-PAGE analysis of endoxanthanase expression and purification

2.2 重組畢赤酵母的發(fā)酵條件優(yōu)化

畢赤酵母對不同外源蛋白的表達水平有很大差異，除外源蛋白本身的性質(zhì)、畢赤酵母的啟動子等影響外，畢赤酵母的發(fā)酵條件也影響著外源蛋白的表達水平。畢赤酵母的最適生長溫度為28～30 ℃，溫度影響畢赤酵母的菌體生長速率、產(chǎn)物的合成方向及速率等[18]，考察了不同發(fā)酵溫度對重組畢赤酵母表達黃原膠內(nèi)切酶的影響(圖4-a)。畢赤酵母在pH為3～7的條件下都能正常生長，但各工程菌本身的發(fā)酵特性和產(chǎn)物的理化性質(zhì)各有差別[12]，導致所需的最適pH各不相同，分別在不同pH下對重組畢赤酵母進行發(fā)酵(圖4-b)，以尋求重組畢赤酵母表達黃原膠內(nèi)切酶所需的最適pH值。發(fā)酵液中的溶氧量直接影響畢赤酵母的生長和代謝，一般通過調(diào)節(jié)轉速等控制溶氧量；合適的接種比能保證在畢赤酵母快速生長的同時大量產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[15]。所以對發(fā)酵轉速(圖4-c)和接種比(圖4-d)進行了優(yōu)化。在搖瓶水平，重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12表達黃原膠內(nèi)切酶的最佳發(fā)酵條件為30 ℃、pH 6.0、220 r/min、接種量5%。

參照搖瓶水平的優(yōu)化條件，對重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12進行7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，結果如圖5所示，隨著發(fā)酵的進行，重組畢赤酵母菌體干重最終達到80.53 g/L，蛋白含量與黃原膠內(nèi)切酶酶活力分別達到501.12 mg/L和1 230.25 U/L，而搖瓶發(fā)酵只有185.64 mg/L和407.13 U/L，分別提高了2.7和3.0倍。

a-溫度；b- pH；c-轉速；d-接種量
圖4 重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化
Fig.4 Optimization of fermentation conditions for recombinant Pichia pastoris-pGAP9K-EX-12 in the shake flasks

a-搖瓶；b-7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)
圖5 重組畢赤酵母-pGAP9K-EX-12的發(fā)酵曲線
Fig.5 Fermentation curve of recombinant Pichia pastoris-pGAP9K-EX-12

2.3 黃原膠內(nèi)切酶酶學性質(zhì)

重組黃原膠內(nèi)切酶的酶學性質(zhì)如圖6所示。黃原膠內(nèi)切酶的最適作用pH為6.0，在pH為5.5～7.5、4 ℃ 放置3 h 后，其酶活力仍可達90%以上，說明重組黃原膠內(nèi)切酶具有較寬的pH耐受性。重組黃原膠內(nèi)切酶的酶活力隨著溫度的上升先提高再下降，在40 ℃達到最大，高于45 ℃時，酶活力急速下降，可能是溫度過高導致酶的結構發(fā)生了改變。在20～45 ℃ 放置 3 h 后，殘留酶活力仍可達70%以上，在很寬的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出相對較高的活性。在最佳條件(40 ℃，pH 6.0)下測定黃原膠內(nèi)切酶的比活力為2 700 U/g。

黃原膠主鏈的結構與纖維素類似，姜海珠等[19]將來自Clostridium thermocellum的纖維素酶在大腸桿菌中進行表達，發(fā)現(xiàn)其能一定程度上降解黃原膠，比酶活力為98.3 U/g。NANKAI等[20]發(fā)現(xiàn)來自Bacillus sp.GL-1的黃原膠內(nèi)切酶對天然的黃原膠作用效果不明顯，比酶活力為9.2 U/g。MOROZ等[21]將來自Paenibacillus nanensis黃原膠內(nèi)切酶在枯草芽孢桿菌中表達的比酶活力為285 U/g。本研究在畢赤酵母中表達的重組黃原膠內(nèi)切酶具有相對較高的酶活力和穩(wěn)定性，使其成為工業(yè)生產(chǎn)低分子質(zhì)量黃原膠的理想候選酶。

2.4 低分子質(zhì)量黃原膠的制備

研究發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量在300～1 500 Da的黃原膠可以促進對人體有益的腸道微生物的生長和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，具有益生活性，可以作為益生元而被廣泛應用[22-23]。在大腸桿菌中進行表達來自Clostridium thermocellum的纖維素酶可將黃原膠部分降解為分子質(zhì)量為4.5×104 Da的低分子質(zhì)量黃原膠[19]；在枯草芽孢桿菌表達來自Paenibacillus nanensis黃原膠內(nèi)切酶的水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要在1 500 Da左右[21]。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性；c-最適溫度；d-溫度穩(wěn)定性
圖6 黃原膠內(nèi)切酶酶學性質(zhì)
Fig.6 Enzymatic properties of endoxanthanase

利用HPSEC法測定了純化后水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量(Mw)與保留時間(t)的關系, 以lgMw為縱坐標, 保留時間為橫坐標, 繪制標準曲線如圖7-a所示, 為lg(Mw)=13.1-0.515t，R2=0.996。待黃原膠內(nèi)切酶水解黃原膠(2.8×107 Da)5 h 后，將得到的水解產(chǎn)物提純并測定其分子質(zhì)量(圖7-b)。

a-標準曲線；b-水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布
圖7 水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布
Fig.7 Molecular weight distribution of hydrolysate

分別由標準曲線、峰面積計算其分子質(zhì)量及比例，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為2.3×107Da 左右的占26.42%，分子質(zhì)量為1 400 Da左右的占73.58%，說明重組黃原膠內(nèi)切酶可以有效水解黃原膠，但水解產(chǎn)物中仍存在分子質(zhì)量較大的黃原膠，推測是一些結構復雜的區(qū)域沒有被完全水解。因此，利用畢赤酵母異源表達的黃原膠內(nèi)切酶可以有效制備低分子質(zhì)量黃原膠。

3 結論

本研究成功將來自Microbacterium sp.XT11的黃原膠內(nèi)切酶在畢赤酵母GS115表達，以GAP為啟動子的重組畢赤酵母的最優(yōu)發(fā)酵條件為30 ℃、pH 6.0、220 r/min、接種量5%，經(jīng)7-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)后酶活力可達1 230.25 U/L，最適作用條件為pH 6.0，40 ℃。將黃原膠內(nèi)切酶作用于黃原膠，水解產(chǎn)物大部分為分子質(zhì)量在1 400 Da 左右的低分子質(zhì)量黃原膠。為低分子質(zhì)量黃原膠的工業(yè)制備提供了一種可行的途徑。