黑曲霉木聚糖酶在大腸桿菌中的胞外表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

植物細(xì)胞壁中有豐富的多糖成分，包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。其中，半纖維素是僅次于纖維素的可再生資源，但轉(zhuǎn)化率較低，是亟待開(kāi)發(fā)的生物物質(zhì)[1]。木聚糖酶是一類(lèi)能將木聚糖降解為低聚木糖和木單糖的酶系。其中，β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶(β-D-1,4 endoxylanase,xynA)(EC 3.2.1.8) 以?xún)?nèi)切的方式降解主鏈上的β-1,4糖苷鍵，生成低聚木糖。其次，β-D-1,4木糖苷酶 (EC 3.2.1.37)從還原端釋放木糖。此外，α-L-阿拉伯糖苷酶 (EC 3.2.1.55) 和α-L-葡萄糖醛酸苷酶 (EC 3.2.1.139) 催化木聚糖中支鏈糖苷鍵的斷裂，加速低聚木糖的形成[2]。在上述酶系當(dāng)中，β-D-1,4內(nèi)切木聚糖酶是木聚糖水解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，受到的關(guān)注最多。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了約400種不同來(lái)源的xynA基因。大部分木聚糖酶基因來(lái)源于括黑曲霉[3]、米曲霉[4]和里氏木霉[5]等真菌。不同微生物來(lái)源的木聚糖酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)差異較大[6]。真菌木聚糖酶的酶分子質(zhì)量較小，在18～33 kDa，最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為45～60 ℃和3.0～6.5。在酶的穩(wěn)定性方面，多數(shù)真菌來(lái)源的酶在40～60 ℃較為穩(wěn)定，而pH在2.5～10.0都有較好的穩(wěn)定性[7-8]。為提高木聚糖酶的發(fā)酵水平，近百種不同來(lái)源的木聚糖酶基因已在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)[9]。然而，木聚糖酶在E.coli中主要為胞內(nèi)表達(dá)，不利于酶分離提取。

在本研究中，克隆了來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger) AG11的xynA基因 (GenBank No.XM_001388485.2)，并表達(dá)于E.coli BL21(DE3)，構(gòu)建得到能分泌xynA的重組菌。通過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化提高xynA分泌表達(dá)水平，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

A.niger AG11、E.coli JM109、BL21(DE)感受肽細(xì)胞、質(zhì)粒pET28a(+)和質(zhì)粒pET22b(+)均由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

柱回收試劑盒，Thermo公司；大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶、PrimerSTAR Max DNA 聚合酶，大連TaKaRa公司；氨芐青霉素、質(zhì)粒提取試劑盒、真菌基因組快速提取試劑盒，上海生工公司；一步克隆試劑盒，南京諾維贊公司；酵母粉與胰蛋白胨，Oxoid 公司；底物樺木聚糖，Sigma公司(美國(guó))；蛋白質(zhì)marker和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，上海翊圣公司；蛋白電泳Loading buffer與Bis-Tris預(yù)制凝膠，Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物 5，蛋白胨 10，NaCl 5，自然pH。

PDA培養(yǎng)基 (g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂 15，自然pH。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉基因組的提取

將孢子懸液涂布于PDA固體培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)4～7 d。用無(wú)菌水緩慢刮取固體培養(yǎng)基表面孢子，經(jīng)濾膜過(guò)濾獲得高活性的孢子懸液。將接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h。通過(guò)離心及紗布過(guò)濾收集黑曲霉菌絲體，置于滅菌的研缽中(加液氮)研磨至細(xì)小粉末，用離心管收集待用。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取黑曲霉基因組。

1.2.2 xynA基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

以A.niger AG11基因組為模板，利用引物xynA primerF和xynA pimerR(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到xynA基因。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸50 s，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化并測(cè)序。分別用Nco I和Xho I對(duì)PCR產(chǎn)物、pET-28a(+)和pET-22b(+)載體進(jìn)行雙酶切。PCR產(chǎn)物經(jīng)Solution I分別連接至pET-28a(+)和pET-22b(+)載體的雙酶切片段，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109。為去除內(nèi)含子，以intron primeF和intro primerR(表1)對(duì)重組載體進(jìn)行擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物用磷酸化酶處理后，用Solution I連接酶連接，得到xynA表達(dá)載體pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA。其中，pET-22b(+)載體由于在多克隆位點(diǎn)的上游添加了信號(hào)肽序列，可將外源蛋白從大腸桿菌中高效地引導(dǎo)出胞外，減少包涵體形成，常被用于胞外異源表達(dá)。同時(shí)，由于pelB信號(hào)肽融合在xynA的N端，可能對(duì)xynA的表達(dá)有影響，所以需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.3 重組xynA的表達(dá)

將構(gòu)建的pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE)，得到重組菌pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)和pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)。重組菌分別接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)12 h，再轉(zhuǎn)接至含100 μg/mL氨芐青霉素的TB發(fā)酵培養(yǎng)基中。經(jīng)37 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)至OD600值為1.0時(shí)，用終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)，并于25 ℃和220 r/min下發(fā)酵24 h。

表1 本研究使用的引物
Table 1 Primers used in this study

注：下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)或一步克隆對(duì)應(yīng)的同源臂序列

將重組菌發(fā)酵液離心并收集菌體，用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.5)重懸后于冰水浴中超聲破碎(200 W，超聲3 s，間隔4 s，50次)，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心15 min后將上清液和沉淀分別測(cè)定酶活力，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將上清液中的目標(biāo)條帶切膠回收，用MALDI-TOF/MS對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析[10]。同時(shí)將pET-22b-xynA/BL21(DE)發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE和酶活力檢測(cè)。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化胞外表達(dá)水平

以IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)OD600值為xynA胞外表達(dá)的因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(表2)。將pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)重組菌在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵并比較不同條件對(duì)胞外表達(dá)的木聚糖酶的影響。并通過(guò)計(jì)算各條件下的k值和極差R，確定xynA胞外表達(dá)影響最大的因素[11]。

表2 大腸桿菌分泌表達(dá)xynA的L9(33)正交試驗(yàn)表
Table 2 L9 (33) orthogonal table of the extracellular xynA expresion in E.coli

1.2.5 重組xynA的分離純化

使用鎳親和層析柱對(duì)表達(dá)的xynA進(jìn)行分離純化。將重組菌發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min離心5 min。取25 mL上清液于0.22 μm水系膜過(guò)濾后，上樣至用緩沖液A(50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.5)平衡的HisTrapTM FF。用8%的緩沖液B(50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH 7.5，500 mmol/L咪唑)沖洗純化柱后，xynA于20% B緩沖液(100 mmol/L咪唑)洗脫。用脫鹽柱Sephadex G25脫鹽，置于4 ℃保存，用SDS-PAGE檢測(cè)其純度。

1.2.6 重組xynA酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

最適反應(yīng)溫度：純化后的酶液經(jīng)NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)稀釋至適當(dāng)濃度，分別測(cè)定在35～60 ℃的酶活力。以最高酶活力為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將上述稀釋后酶液分別在40～60 ℃條件下孵育0～90 min后置于冰上保存，測(cè)定各條件下的酶活力。以孵育0 min時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算各孵育時(shí)間下的相對(duì)酶活力。在上述溫度穩(wěn)定性測(cè)定的基礎(chǔ)上擬合不同溫度下的回歸方程，計(jì)算各溫度下木聚糖酶的半衰期[12]。

最適反應(yīng)pH：分別用Na2HPO4-檸檬酸(pH 2.0～5.0)、Na2HPO4- NaH2PO4(pH 6.0～7.0)、Tris-HCl(pH 8.0)和甘氨酸-NaOH(pH 9.0)緩沖液將pH調(diào)至2.0～9.0后測(cè)定酶活力。以最高酶活力為100%，計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活力。

用上述相同的緩沖液，將酶液pH調(diào)至2.0～9.0，在40 ℃條件下孵育1 h后，再將pH調(diào)至4.0測(cè)定酶活力。以孵育0 min時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算各孵育條件下的相對(duì)酶活力。

1.2.7 木聚糖酶酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在酶的最適條件下測(cè)定質(zhì)量濃度為0～25 mg/mL的樺木木聚糖的初始酶活力。基于上述酶反應(yīng)數(shù)據(jù)，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，計(jì)算重組木聚糖酶的Km和kcat[13]。

1.2.8 木聚糖酶酶活力和蛋白含量的測(cè)定

采用3, 5-二硝基水楊酸法測(cè)定木聚糖酶酶活力[14]。將500 μL稀釋至適當(dāng)濃度的酶液與500 μL樺木木聚糖底物(pH 4.0，10 mg/mL)混合，在50 ℃條件下反應(yīng)10 min后用3, 5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)。反應(yīng)的樣品于沸水內(nèi)顯色5 min后立即用水冷卻，并在545 nm條件下測(cè)定吸光度。酶活力單位(U/mL)定義為1 min水解木聚糖所產(chǎn)生的1 μmol還原糖所需的酶量。蛋白濃度的測(cè)定采用了BCA法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 xynA基因的克隆與載體的構(gòu)建

以A.niger AG11基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增xynA基因。電泳分析顯示，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp，與理論值相似(圖1-a)。將PCR產(chǎn)物分別克隆至pET-28a(+)和pET-22b(+)-xynA的Nco I-Xho I位點(diǎn)，得到編碼xynA的質(zhì)粒pET-28a(+)-xynA′和pET-22b(+)-xynA′?；谝徊娇寺》▌h除pET-28a(+)-xynA′和pET-22b(+)-xynA′中xynA的內(nèi)含子序列，進(jìn)一步構(gòu)建得到xynA表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA(圖1-b)。其中，pET-22b(+)-xynA編碼了pelB信號(hào)肽，將促進(jìn)融合在其下游xynA的分泌表達(dá)。上述表達(dá)質(zhì)粒序列均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

M-DNA marker; 1-xynA
a-xynA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物核酸膠圖；b-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA載體圖譜
圖1 xynA基因的克隆與載體構(gòu)建
Fig.1 Cloning of xynA gene and vectors construction

2.2 重組xynA的表達(dá)

將pET-28a(+)-xynA載體轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE)中，轉(zhuǎn)接后OD600值達(dá)到1.0時(shí)添加IPTG，使終濃度為0.1 mmol/L，25 ℃發(fā)酵24 h并收集菌體。經(jīng)超聲破碎，在沉淀和上清液中都有20 kDa左右的條帶(圖2-a)，但空白對(duì)照中不存在該條帶，初步判斷E.coli BL21(DE)成功表達(dá)xynA，同時(shí)存在部分包涵體。用MALDI-TOF/MS對(duì)該條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,確定為A.niger CBS 513.88來(lái)源的木聚糖酶(圖3)。對(duì)胞內(nèi)上清液和沉淀分別測(cè)定酶活力，上清液中xynA活力為10.4 U/mL(圖2-c)，而沉淀中的包涵體不具有活性。

為實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)，將pET-22b(+)-xynA轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE)并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。分別對(duì)胞外上清液、胞內(nèi)上清液和沉淀進(jìn)行酶活力測(cè)定和SDS-PAGE檢測(cè)(圖2-b)。結(jié)果顯示在胞外上清液中存在xynA條帶，而胞內(nèi)上清液和沉淀中也存在對(duì)應(yīng)條帶。其中，pelB作為大腸桿菌中高效的信號(hào)肽，被融合到xynA的N端，可將外源蛋白引導(dǎo)至周質(zhì)空間并轉(zhuǎn)移到胞外，提高xynA的可溶性。在胞外上清液中可測(cè)得xynA活力為8.5 U/mL(圖2-c)。與空白對(duì)照組比較，在SDS-PAGE圖中可基本確定目的條帶(圖2-b)，而在不添加pelB信號(hào)肽的重組菌胞外上清液中未測(cè)得酶活力。以上結(jié)果說(shuō)明，在添加信號(hào)肽后胞內(nèi)部分xynA成功分泌至胞外。同時(shí)，在胞內(nèi)上清液中也檢測(cè)到xynA活力為0.8 U/mL(圖2-c)，并在SDS-PAGE圖上顯示對(duì)應(yīng)條帶(圖2-b)，表明胞內(nèi)依然存在部分包涵體，需進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件。

M-蛋白質(zhì)marker；1-pET-28a(+)胞內(nèi)上清液空白對(duì)照；2-pET-28a(+)-xynA胞內(nèi)上清液；3-pET-28a(+)胞內(nèi)胞內(nèi)沉淀空白對(duì)照；
4-pET-28a(+)-xynA胞內(nèi)沉淀；5-pET-22b(+)胞內(nèi)上清液空白對(duì)照；6-pET-22b(+)-xynA胞外上清液；
7-pET-22b(+)-xynA胞內(nèi)上清液；8-pET-22b(+)-xynA胞內(nèi)沉淀；9-純化后的xynA條帶；10-pET-28a(+)/BL21(DE)空白對(duì)照；
11-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)上清液酶活力；12-pET-28a(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)沉淀酶活力；13-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)
胞外上清液酶活力；14- pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)上清液酶活力；15-pET-22b(+)-xynA/BL21(DE)胞內(nèi)沉淀酶活力
a-pET-28a(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達(dá)的SDS-PAGE圖；b-pET-22b(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達(dá)的SDS-PAGE圖；
c-pET-28a(+)-xynA和pET-22b(+)-xynA在E.coli BL21(DE)中表達(dá)的酶活力柱狀圖
圖2 重組xynA的表達(dá)情況分析
Fig.2 Expression analysis of recombinant xynA

圖3 重組xynA的MALDI-TOF/MS檢測(cè)結(jié)果
Fig.3 MALDI-TOF/MS result of recombinant xynA

2.3 重組xynA的分泌表達(dá)優(yōu)化

分別取各組24 h和36 h時(shí)的發(fā)酵液，對(duì)比胞外上清液中的xynA活力。在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為20 ℃、誘導(dǎo)OD600值為0.5，發(fā)酵至24 h時(shí)的酶活力為10.2 U/mL，比未經(jīng)優(yōu)化的條件下，發(fā)酵至24 h時(shí)的酶活力提高20%。在發(fā)酵36 h時(shí)胞外有15.8 U/mL的最高酶活力，比初始條件下提高85.9%(圖4-a)。對(duì)該組收集的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，顯示胞內(nèi)沉淀中的包涵體量有較明顯的減少(圖4-b)。

對(duì)36 h時(shí)各組胞外酶活力的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分別計(jì)算各因素下的k值和極差R，結(jié)果如表3所示。IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度的極差R高于誘導(dǎo)OD600值的極差，表明前2個(gè)因素對(duì)xynA胞外表達(dá)水平的影響更大。IPTG終濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)可減少包涵體的形成。但發(fā)酵36 h的胞外酶活力比24 h的酶活力高55%，說(shuō)明20 ℃低溫誘導(dǎo)xynA需要更長(zhǎng)的時(shí)間表達(dá)。而30 ℃發(fā)酵36 h的胞外酶活力低于24 h，較高溫度下誘導(dǎo)可以加速xynA的分泌表達(dá)，但發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使xynA部分失活。適當(dāng)?shù)亟档驼T導(dǎo)溫度，延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可以提高xynA的可溶性表達(dá)水平。

表3 36 h發(fā)酵時(shí)間下不同因素的k值和極差R
Table 3 The k value and the range R of different factors under 36 h fermentation time

M-蛋白質(zhì)marker；1-初始條件下的胞內(nèi)沉淀；
2-最佳優(yōu)化條件下的胞內(nèi)沉淀
a-正交試驗(yàn)各組條件下胞外xynA活力柱狀圖；b-初始條件與最佳條件下胞外沉淀的SDS-PAGE圖
圖4 重組xynA胞外表達(dá)條件優(yōu)化
Fig.4 Optimizing extracellular expression of recombinant xynA

2.4 重組xynA的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 重組xynA的純化和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心并用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，用20%的500 mmol/L B液洗脫xynA，獲得單一的目的蛋白條帶。蛋白條帶與理論值相符，且無(wú)雜帶(圖2-b)。脫鹽后分別測(cè)定蛋白濃度和酶活力，計(jì)算得重組xynA的比酶活為175.1 U/mg。當(dāng)以樺木木聚糖為底物時(shí)，測(cè)定重組xynA的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4所示。

表4 以樺木木聚糖為底物時(shí)的重組xynA動(dòng)力學(xué)參數(shù)
Table 4 Kinetic parameters of xynA with betula xylan as substrate

2.4.2 重組xynA的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定

如圖5所示，在25～60 ℃，重組xynA的酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50 ℃時(shí)測(cè)得最高酶活力。在25～50 ℃酶活力緩慢上升，25 ℃反應(yīng)條件下有60%以上的相對(duì)酶活，說(shuō)明在該溫度范圍內(nèi)xynA較穩(wěn)定。但當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)50 ℃，xynA的相對(duì)酶活顯著下降，55 ℃時(shí)相對(duì)酶活力下降了40%，反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力降至50%以下 (圖5-a)。以上結(jié)果說(shuō)明50 ℃ 為xynA的最適反應(yīng)溫度，但當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)50 ℃，相對(duì)酶活顯著下降，xynA在該反應(yīng)溫度下表現(xiàn)出較差的酶活力。

a-重組xynA最佳反應(yīng)溫度曲線(xiàn)；b-重組xynA溫度穩(wěn)定性曲線(xiàn)；c-重組xynA不同溫度下的半衰期柱狀圖；d-重組xynA最佳反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性曲線(xiàn)
圖5 溫度和pH對(duì)重組xynA活性的影響
Fig.5 The influence of temperature and pH on the activity of recombinant xynA

孵育溫度為40 ℃時(shí)xynA呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，相對(duì)酶活力保持在97%以上，孵育時(shí)間為90 min時(shí)未表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。但當(dāng)溫度上升至55 ℃，孵育5 min時(shí)殘留酶活力僅為8%，10 min時(shí)xynA全部失活，而60 ℃ 孵育5 min時(shí)已檢測(cè)不到xynA的酶活力(圖5-b)。經(jīng)計(jì)算得xynA在40 ℃的半衰期為182 min。而45、50、55 ℃的半衰期分別僅為40 ℃時(shí)的33.3%、10%和2.6% (圖5-c)。表明xynA在40 ℃時(shí)具有最佳的熱穩(wěn)定性，而高于40 ℃熱穩(wěn)定性顯著下降。

2.4.3 重組xynA的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性測(cè)定

當(dāng)反應(yīng)體系的pH為4.0時(shí)測(cè)得xynA的最高酶活力,在pH為2.0～5.0相對(duì)酶活力都高于70%，說(shuō)明在該反應(yīng)條件下xynA具有較高的活力。而當(dāng)pH高于6.0，酶的活力有較大程度的下降，pH為9.0時(shí)，相對(duì)酶活力僅為10%(圖5-d)。由此可知，重組xynA的最佳反應(yīng)pH為4.0，在酸性反應(yīng)條件下具有較好的酶活力，而在堿性條件下酶的活力顯著降低。

為了測(cè)定xynA在不同pH條件下的耐受性，設(shè)定孵育pH為2.0～9.0。在pH為4.0時(shí)有最佳的相對(duì)酶活力，說(shuō)明在該條件下xynA最為穩(wěn)定。而在其他pH條件下，相對(duì)酶活力保持在70%以上(圖5-d)。重組xynA具有較大范圍的pH穩(wěn)定性，在酸堿條件下保存較長(zhǎng)時(shí)間依然具有較高的酶活力。

3 結(jié)論與討論

木聚糖酶能夠催化植物細(xì)胞中的半纖維素生成能夠利用的低聚木糖，在生產(chǎn)生活中有較多應(yīng)用，包括食品、醫(yī)藥、飼料和生物能源等方面[15-16]。其中，不同來(lái)源的木聚糖酶在大腸桿菌中異源表達(dá)的報(bào)道最多[17]。雖然大腸桿菌繁殖速度快，操作方便，是比較理想的宿主細(xì)胞，但是由于蛋白質(zhì)常存在于細(xì)胞內(nèi)無(wú)法分泌至胞外，只能通過(guò)破壁的方法將目的蛋白釋放出來(lái)，從而增加酶的損失[18]。本研究成功構(gòu)建了重組xynA在大腸桿菌中的分泌表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)正交試驗(yàn)減少包涵體的形成，提高了胞外表達(dá)水平。從而降低工業(yè)生產(chǎn)中的成本，提高生產(chǎn)效率。同時(shí)對(duì)xynA 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，最適反應(yīng)溫度和pH分別為50 ℃和4.0，在pH為2.0～9.0都有較好的穩(wěn)定性，在飼料、生物乙醇等酸性制作過(guò)程中都有較高的使用潛力[19]。但由于在高溫下較差的穩(wěn)定性限制了其廣泛應(yīng)用。

為了滿(mǎn)足實(shí)際生產(chǎn)時(shí)對(duì)熱穩(wěn)定性的要求，需要通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)酶進(jìn)行改造。本文構(gòu)建的木聚糖酶表達(dá)菌株成功將xynA分泌至胞外，可通過(guò)定向進(jìn)化或者理性改造技術(shù)提高該酶的熱穩(wěn)定性[20]。同時(shí)，利用易錯(cuò)PCR、飽和突變等擴(kuò)大突變文庫(kù)，并結(jié)合高通量篩選技術(shù)，大大方便正向突變株的篩選，為后續(xù)重組xynA的分子改造提供重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[21]。