玉米谷蛋白水解物對乙醇誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞的保護(hù)作用

氧化應(yīng)激是指在體內(nèi)外有害因素刺激下，體內(nèi)自由基增加或機(jī)體抗氧化保護(hù)能力減弱，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。在此狀態(tài)下，過多積累的活性氧(reactive oxygen species，ROS)會造成核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的損傷，進(jìn)而可能導(dǎo)致慢性退行性疾病的發(fā)生[2-5]。抗氧化劑可通過中和自由基、清除氧化劑或防止氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜?qiáng)的化合物，減緩或抑制細(xì)胞損傷，達(dá)到抗氧化的目的[6]?？寡趸瘎┯挚煞譃槿斯ず铣煽寡趸瘎┖吞烊豢寡趸瘎?。近幾年來，因人工合成抗氧化劑的安全性受到質(zhì)疑，所以尋找來源安全的天然抗氧化劑具有必要性。

玉米蛋白粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的主要副產(chǎn)物之一，其中玉米谷蛋白含量占其總蛋白含量的22%左右[7]，玉米谷蛋白中富含谷氨酰胺，谷氨酰胺是細(xì)胞增殖的主要能源，又是合成體內(nèi)極其重要的抗氧化劑——還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前體物質(zhì)[8]。然而由于玉米谷蛋白水溶性差等的原因，限制了其功能性的發(fā)揮和在食品工業(yè)中的應(yīng)用[7-9]。有研究[10-11]表明，通過蛋白酶水解的方式可以改善蛋白質(zhì)的溶解度。而目前有關(guān)玉米谷蛋白水解物(corn gluten hydrolysate，CGH)的研究主要集中于水解物的制備及其物性研究等方面。LI等[10]采用單酶水解玉米谷蛋白，探討不同水解時間的谷蛋白酶解物抗氧化活性，得到具有較高抗氧化活性的CGH，本試驗(yàn)采用雙酶協(xié)同水解玉米谷蛋白，不但減少了加酶量和水解時間，還提高了水解物的抗氧化活性。楊翠等[12]采用堿性蛋白酶水解玉米谷蛋白得到CGH，然后采用超濾、凝膠過濾層析和高效液相色譜法分離純化CGH，發(fā)現(xiàn)CGH具有良好的抗氧化活性。以上的研究均使用化學(xué)法來評估CGH的抗氧化活性，化學(xué)法雖然快速，但無法反映體內(nèi)復(fù)雜的生理過程和作用機(jī)理，而細(xì)胞模型法能準(zhǔn)確模擬生物環(huán)境。目前，尚未見用細(xì)胞模型法評估CGH抗氧化活性的相關(guān)報道。本文采用雙酶協(xié)同水解法獲得CGH，采用乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷模型對CGH的抗氧化應(yīng)激作用進(jìn)行研究，為CGH在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；α-淀粉酶(2.0×105 U/g)，食品級，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；堿性蛋白酶(2.1×105 U/g)、復(fù)合蛋白酶(2.3×104 U/g)，食品級，丹麥諾維信公司；DPPH(純度≥95%)、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′, 7′-dichlorofluorescent yellow diacetate，DCFH-DA)，美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)(高糖)和胰蛋白酶，美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，德國PAN公司；噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10型pH計，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PC/PLC-LD-53型冷凍干燥機(jī)，美國MILLROCK公司；NV4750E二氧化碳培養(yǎng)箱，NUAIRE(美國)公司；LX73熒光倒置顯微鏡，Olympus(日本東京)公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默(美國)公司產(chǎn)品；96孔板、6孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和移液管，Corning(美國)公司。

1.3 CGH的制備

精確稱取一定量的玉米谷蛋白，配制成pH 7.0，底物質(zhì)量濃度為5 g/100L的蛋白懸液，先后加入復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行水解，復(fù)合蛋白酶加量為0.6 g/100g底物，水解(溫度50 ℃，pH 7.0)60 min后立即用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至8.5，升溫至60 ℃，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶加量為2 g/100g底物，水解(溫度為60 ℃，pH 8.5)50 min，反應(yīng)結(jié)束后于沸水中滅酶15 min，于4 000 r/min離心15 min，將上清液冷凍干燥后備用。

1.4 蛋白含量測定

采用微量凱式定氮法，按GB 5009.5—2010執(zhí)行。

1.5 水解度(degree of hydrolysis，DH)測定

采用pH-stat法[7]測定水解度。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被蛋白酶水解時，肽鍵斷裂，有羧基和氨基產(chǎn)生，會使反應(yīng)體系的pH值下降。通過滴加NaOH溶液使水解液維持pH穩(wěn)定，再通過加入的NaOH溶液體積來衡量肽鍵的斷裂情況，計算出玉米蛋白的DH。DH計算如公式(1)所示：

(1)

式中：VNaOH，反應(yīng)中消耗的堿體積，mL；NNaOH，反應(yīng)中維持pH穩(wěn)定時堿當(dāng)量濃度，mol/L；α，α-氨基酸解離度；Mp，反應(yīng)體系中的蛋白總量，g；htot，1 g蛋白中肽鍵的克當(dāng)量數(shù)，玉米蛋白取8.38。

1.6 抗氧化活性測定

將凍干后的CGH配成蛋白質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的溶液，測定抗氧化活性。參考文獻(xiàn)[7]的方法測定CGH的DPPH自由基清除能力、羥自由基(·OH)清除能力和Fe2+螯合能力。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

LO2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、CO2含量為5 L/100L的培養(yǎng)箱中，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用20～30代細(xì)胞。

1.8 MTT法測定CGH對LO2細(xì)胞存活率的影響

參照文獻(xiàn)[13]的方法，將對數(shù)期LO2細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105 cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h，然后每孔加入100 μL終質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200、300、400、500、1 000、2 000 μg/mL的CGH培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后每孔加入終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，在37 ℃ 500 r/min微孔板振蕩儀振蕩10 min，在490 nm用酶標(biāo)儀檢測OD值，測定細(xì)胞存活率。

1.9 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建

將對數(shù)期LO2細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105 cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分為樣品組和對照組，樣品組每孔加入100 μL乙醇溶液(1640培養(yǎng)基配制)，使終體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%，對照組每孔加入100 μL不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后測細(xì)胞存活率，測定方法同1.8。

1.10 CGH對乙醇誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞的保護(hù)作用

取對數(shù)期LO2細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×105 cells/mL接種至96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)6 h，實(shí)驗(yàn)分為樣品組、酒精組和對照組。待細(xì)胞貼壁后，樣品組中每孔加入100 μL樣品溶液，使樣品終質(zhì)量濃度為25、50、75、100、200 μg/mL，對照組和酒精組各加入100 μL不完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h 后對照組加入100 μL不完全培養(yǎng)基，樣品組和酒精組加入100 μL終體積分?jǐn)?shù)為4%的乙醇溶液，將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后測細(xì)胞存活率，測定方法同1.8。

1.11 CGH對LO2細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力測定

參照文獻(xiàn)[11]的方法測定細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力。

1.12 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用SPSS Statistics19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用單因素方差分析[最小顯著差別(least significant difference，LSD)檢驗(yàn)]，P<0.05為差異性顯著水平。用Graph Pad Prism 5繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGH體外抗氧化活性分析

如表1所示，CGH能夠有效清除·OH、DPPH自由基和提高Fe2+螯合能力，且在一定范圍濃度內(nèi)，抗氧化活性隨著CGH濃度的增加而遞增；當(dāng)CGH的蛋白質(zhì)量濃度在2 mg/mL時，其對·OH清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別為(86.69±0.022)%、(60.56±0.369)%和(91.58±0.025)%，表明CGH具有良好的抗氧化活性。

表1 CGH的濃度對·OH清除能力、DPPH自由基清除能力和Fe2+螯合能力的影響 單位；%

Table 1 Effects of CGH concentration on ·OH scavenging rate，DPPH free radical scavenging rate and Fe2+ chelating rate

從表1中可以看出，CGH具有很好的·OH清除能力、DPPH自由基清除能力和Fe2+螯合能力。酶法改性使得一些配位能力較強(qiáng)的基團(tuán)例如羰基裸露出來，易于與Fe2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使其具有更好的金屬離子鰲合能力[14]。CGH良好的金屬螯合能力可以通過螯合Fe2+來阻止Fe2+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH。同時，CGH中一些疏水性基團(tuán)的暴露，增強(qiáng)了其與DPPH自由基反應(yīng)能力，從而提升了對DPPH自由基的清除能力。這與王曉杰等[14]的研究一致。以上結(jié)果表明CGH既是良好的供氫體，也是Fe2+螯合劑，能通過抑制Fenton反應(yīng)而減少羥基的生成，提高自由基的清除能力，從而消除自由基對機(jī)體造成的氧化性損傷。

2.2 CGH對LO2細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，不同濃度的CGH對LO2細(xì)胞存活率存在顯著性差異(P<0.05)，與對照組相比，CGH質(zhì)量濃度為12.5～2 000 μg/mL時，細(xì)胞存活率均大于對照組細(xì)胞存活率，即可在此濃度范圍內(nèi)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

從圖1中可以看出質(zhì)量濃度為25～2 000 μg/mL時，細(xì)胞存活率顯著高于空白對照組(P<0.05)，這是由于水解物中的一些小分子肽作為營養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)胞吸收，從而促進(jìn)了LO2細(xì)胞的增殖。

圖1 CGH對LO2細(xì)胞存活率的影響
Fig.1 The effect of CGH on the survival rate of LO2 cells
注：不同小寫字母表示樣本間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(下同)

2.3 乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷的模型建立

乙醇在細(xì)胞代謝過程中會產(chǎn)生大量的ROS和超氧陰離子，過量的自由基可引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-17]。

乙醇誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞模型的建立，是利用一定濃度的乙醇溶液作用細(xì)胞，使細(xì)胞損傷程度在60%～70%，然后完成生物活性物質(zhì)相應(yīng)功能的評價。因此，有必要探索在不同濃度乙醇條件下，LO2細(xì)胞存活率的情況，確定乙醇誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞的最佳作用濃度。通過MTT法測定不同體積分?jǐn)?shù)0.5%、1%、2%、3%、4%、5%乙醇對LO2細(xì)胞存活率的影響，不同濃度乙醇作用LO2細(xì)胞24 h，然后測定細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對LO2細(xì)胞存活率的影響
Fig.2 The effect of ethanol concentration on the survival rate of LO2 cells

從圖2中可以看出，不同濃度的乙醇對LO2細(xì)胞的生長均有一定抑制作用，且細(xì)胞存活率隨乙醇濃度的增加而減小，各乙醇濃度處理組與對照組相比均有極顯著差異(P<0.05)。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%時，LO2細(xì)胞的存活率為(73.22±3.88)%，此濃度下的乙醇溶液對細(xì)胞損傷效果顯著(P<0.05)。在光學(xué)顯微鏡下觀察不同濃度乙醇處理的細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形，形態(tài)完整，大小均一；乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%時，細(xì)胞的形態(tài)與正常組基本無差異，乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%、4%時，細(xì)胞密度顯著減少(P<0.05)，形態(tài)未有顯著變化；乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時，細(xì)胞密度顯著減少(P<0.05)且大部分細(xì)胞已經(jīng)失去原有細(xì)胞形態(tài)。因此建模時乙醇的最佳體積分?jǐn)?shù)可選取4%。這與黃素瓊等[13]的研究結(jié)果一致。

2.4 CGH對乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

利用前期已建立成功的乙醇誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞模型，研究CGH對乙醇誘導(dǎo)氧化損傷LO2細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為4%，樣品的質(zhì)量濃度梯度為25、50、75、100、200 μg/mL。結(jié)果如圖3所示。

圖3 CGH對乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷的影響
Fig.3 Effect of CGH on ethanol induced oxidative damage in LO2 cells

從圖3中可以看出，模型組的LO2細(xì)胞存活率只有(87.58±4.37)%，而加入不同濃度CGH的LO2細(xì)胞存活率均高于(87.58±4.37)%，即適當(dāng)濃度的CGH可顯著提高LO2細(xì)胞存活率(P<0.05)。以上結(jié)果表明CGH可以有效降低乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞的氧化損傷作用，且隨著CGH濃度的升高，其對LO2細(xì)胞的保護(hù)作用愈加明顯。推測CGH能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系活力，提高細(xì)胞抗氧化能力，進(jìn)而抵御氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞。任嬌艷等[15]發(fā)現(xiàn)河蜆酶解物能夠有效降低乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞的氧化損傷作用，且不同濃度酶解物作用細(xì)胞后的細(xì)胞存活率的趨勢與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 CGH對乙醇損傷后LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的調(diào)節(jié)作用

ROS是細(xì)胞內(nèi)氧分子結(jié)合電子后的產(chǎn)物，包括超氧陰離子、H2O2和·OH等，在細(xì)胞中能與生物大分子結(jié)合，破壞其生理活性，進(jìn)而對細(xì)胞造成損傷。圖4為不同濃度CGH作用LO2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS相對水平。

圖4 CGH對乙醇損傷后的LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響
Fig.4 Effect of CGH on ROS content in LO2 cells after ethanol injury

從圖4中可以看出，與對照組相比，經(jīng)4%乙醇誘導(dǎo)損傷后的LO2細(xì)胞中ROS含量顯著提高(P<0.05)，表明乙醇誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量大量積累。與損傷組相比，經(jīng)不同濃度CGH預(yù)處理后LO2細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著下降(P<0.05)。CGH在25 μg/mL時對處理組細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力較損傷組提高約3倍。

圖5中的系列照片表示的是CGH在不同濃度下預(yù)處理LO2細(xì)胞后，用熒光倒置顯微鏡拍攝的細(xì)胞熒光照片。其中圖5-a為對照組，圖5-b為4%乙醇誘導(dǎo)損傷組，圖5-c～圖5-e依次為蛋白質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL CGH預(yù)處理組。

a-對照；b-損傷；c-25 μg/mL蛋白；d-50 μg/mL蛋白；e-100 μg/mL蛋白
圖5 LO2熒光圖片
Fig.5 LO2 cell fluoresence photograph

從圖5中可以看出，LO2細(xì)胞經(jīng)乙醇誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量較高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)?？赡苁且掖歼M(jìn)入LO2細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，當(dāng)DCFH進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化成DCF，使細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS值變大。經(jīng)不同濃度的CGH處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均有所減弱。綜合圖4和圖5可以看出，當(dāng)CGH質(zhì)量濃度為25 μg/mL時，ROS含量最低，熒光強(qiáng)度最弱?？赡苁堑蜐舛鹊腃GH可以正向調(diào)節(jié)Nrf2通路，進(jìn)而減少ROS的產(chǎn)生，而高濃度的CGH會激活Nrf2通路的逆反應(yīng)，削弱CGH對ROS的清除能力。我們推測是CGH中含有一定量的谷氨酰胺，谷氨酰胺能夠通過調(diào)節(jié)Nrf2通路減輕因乙醇引起的細(xì)胞氧化損傷，減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[16]。WANG等[17]以玉米蛋白為原料，研究玉米蛋白對氧化損傷的肝癌細(xì)胞的ROS清除能力的影響，發(fā)現(xiàn)玉米蛋白具有很好的ROS清除能力。

2.6 CGH對LO2細(xì)胞內(nèi)SOD的影響

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在人體氧化和抗氧化的平衡中起作用，可以通過清除過量的超氧陰離子自由基來保護(hù)細(xì)胞[18]。圖6為不同濃度CGH作用乙醇誘導(dǎo)損傷的LO2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)SOD活力。

圖6 CGH對乙醇誘導(dǎo)損傷的LO2細(xì)胞內(nèi)SOD活力的
影響
Fig.6 Effect of CGH on SOD activity in LO2 cells injured by ethanol

從圖6中可以看出，LO2細(xì)胞在經(jīng)乙醇誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞內(nèi)SOD活力顯著降低(P<0.05)。與氧化損傷組相比，CGH預(yù)處理后再進(jìn)行氧化損傷，測得的細(xì)胞內(nèi)SOD活力得到顯著提高(P<0.05)，CGH在50 μg/mL時，使損傷的細(xì)胞內(nèi)SOD活力提高了24 U/mg prot?？梢钥闯?，一旦細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，CGH可提高SOD活力，使細(xì)胞免受氧化損傷。

2.7 CGH對LO2細(xì)胞內(nèi)GR和GSH水平的影響

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)可以催化谷胱甘肽二硫化物(glutathione disulfide，GSSH)還原為GSH，GSH負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)過量自由基[19]，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷中發(fā)揮著重要的作用。不同濃度CGH作用LO2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GR活力和GSH水平如圖7所示。

a-GR活力；b-GSH水平
圖7 CGH對乙醇誘導(dǎo)損傷的LO2細(xì)胞內(nèi)GR活力和GSH水平的影響
Fig.7 Effect of CGH on GR activity and GSH level in ethanol induced LO2 cells

從圖7中可以看出，乙醇作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的GR活力和GSH水平顯著降低(P<0.05)，經(jīng)一定濃度的CGH預(yù)處理后的LO2細(xì)胞GR活力和GSH水平較損傷組顯著升高(P<0.05)。表明CGH能夠提高乙醇誘導(dǎo)損傷細(xì)胞內(nèi)的GR活力和GSH水平，減輕乙醇對LO2細(xì)胞的氧化損傷，可能是CGH調(diào)控了谷胱甘肽系統(tǒng)，提升了GR的活性，清除細(xì)胞內(nèi)過量自由基，進(jìn)而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。WANG等[19]研究了玉米蛋白抗氧化肽對HepG2細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力和總GSH水平的調(diào)控作用，結(jié)果表明玉米肽可以提高過氧化氫誘導(dǎo)損傷細(xì)胞的抗氧化酶活力。

3 結(jié)論

CGH具有良好的體外抗氧化活性，CGH的·OH清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合率的IC50值分別為0.61、3.96、0.79 mg/mL。細(xì)胞試驗(yàn)表明CGH對細(xì)胞無毒性作用，且能顯著改善乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。CGH能夠降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，還能提高SOD和GR的活力及GSH水平，對乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞氧化損傷具有較為明顯的保護(hù)作用。本研究為玉米源抗氧化功能食品及食品基料奠定理論基礎(chǔ)。