上海市市售低溫酸奶中細(xì)菌多樣性的初步研究

酸奶作為乳制品中重要的成員，以其獨(dú)特的風(fēng)味、極高的營養(yǎng)價值倍受人們青睞。酸奶不但口感美味，而且具有促進(jìn)消化吸收、維護(hù)腸道健康的功能。隨著酸奶生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大、加工生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈的不正規(guī)化、低質(zhì)量奶源等原因，導(dǎo)致酸奶中存在一些有害細(xì)菌，使消費(fèi)者食用后產(chǎn)生不良反應(yīng)，如腹痛、腹瀉甚至中毒。GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中對大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母和霉菌進(jìn)行了限量規(guī)定?；诂F(xiàn)有的研究，我們發(fā)現(xiàn)存在于酸奶中并可能帶來一定危害的細(xì)菌主要有黃色葡萄球菌、布魯氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌等[1]。部分細(xì)菌在國標(biāo)中并沒有明確的規(guī)定，對酸奶食用安全性造成的影響不得而知，因此酸奶的安全問題值得引起乳制品相關(guān)行業(yè)的高度重視。

常見的酸奶分為自然發(fā)酵和商品化酸奶兩種。自然發(fā)酵的酸奶與市售的商品化酸奶在加工方面存在著一定的差異。研究發(fā)現(xiàn)南疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌群，其中乳桿菌屬、鏈球菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬、芽孢桿菌屬的含量較多[2]。自然發(fā)酵的酸奶通常是牧民(如青藏高原地區(qū))采用傳統(tǒng)而古老的發(fā)酵方法制作的，能夠產(chǎn)生大量優(yōu)良的乳酸菌，具有降低膽固醇、抗氧化等保健功能，但自然發(fā)酵的酸奶中存在較多發(fā)酵菌種外的細(xì)菌。市售酸奶為商品化酸奶，通常采用工廠化加工進(jìn)行大批量生產(chǎn)，上市前對酸奶進(jìn)行質(zhì)量檢測。一般而言，商業(yè)化酸奶的發(fā)酵時間相對較短，乳酸菌活菌數(shù)較多，后酸化作用較弱，但穩(wěn)定性較高。

目前有很多檢測乳制品中細(xì)菌的方法，例如平板培養(yǎng)法、核酸探針法、PCR技術(shù)[3]等，這些技術(shù)具有簡單、易于操作等特點(diǎn)，但當(dāng)不同菌落混雜在一起時，很難同時進(jìn)行定性定量的檢測，且存在一些缺點(diǎn)如周期長、易受人為因素干擾等[4]。MiSeq系統(tǒng)是一種高端測序系統(tǒng)，可以同時進(jìn)行合成與測序操作。隨著Illumina Miseq高通量測序技術(shù)的不斷完善、發(fā)展，現(xiàn)已成功應(yīng)用在多個方面，如朱瀟等[5]利用該技術(shù)分析牦牛發(fā)酵乳制品中細(xì)菌菌群多樣性；盧圣鄂等[6]將該技術(shù)用于分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究采用宏基因組測序法，對酸奶樣品進(jìn)行細(xì)菌采集測序，檢測出酸奶中可能存在的細(xì)菌，并進(jìn)行分類分析，從原料乳、加工生產(chǎn)及包裝運(yùn)輸3個方面分析可能來源。

1 材料與方法

1.1 材料

酸奶樣品于2021年3月2日購于上海泥城大潤發(fā)超市冷藏酸奶專區(qū)(0～4 ℃)。如表1所示，一共為16份樣品，包括國內(nèi)8種知名品牌的酸奶A、B、C、D、E、F、G、H，以及A品牌不同系列的酸奶樣品8份(A1～A8)，其中A與A5為平行對照樣品。全程保證冷鏈保藏，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酸奶樣品
Table 1 Yogurt samples

1.2 儀器與設(shè)備

FastPre-24 MP型組織均質(zhì)器，美國MP Biomedicals公司；#DP328型糞便基因組DNA試劑盒，天根生化有限科技公司；SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰Biotek儀器有限公司；PowerPac HC電泳儀，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；5331PCR儀，美國Biometra公司；22331Eppendorf AG離心機(jī)，德國Hamburg公司；DW-40L508醫(yī)用低溫保存箱、HYC-290醫(yī)用冷藏箱，青島Haier特種電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測序儀，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

用FastPre-24 MP組織均質(zhì)器將樣品進(jìn)行均質(zhì)混勻，用移液槍吸取200 μL樣品于EP離心管中備用。

1.3.2 樣品基因組DNA提取

樣品基因組DNA提取采用糞便基因組DNA試劑盒，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3.3 基因組DNA濃度及純度的檢測

通過酶標(biāo)儀對樣品的DNA濃度以及純度進(jìn)行測定分析。基因組DNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)菌的16S rRNA V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增

以總DNA為模板利用細(xì)菌16S rRNA引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[7]實(shí)現(xiàn)V3～V4可變區(qū)的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min，35個循環(huán)(94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min)。擴(kuò)增體系為50 μL，25 μL Premix Tap，2 μL dNTPs，4 μL引物(5 mol/L)，1 μL DNA模板，18 μL滅菌蒸餾水。

1.3.5 Illumina Miseq 測序

將PCR擴(kuò)增子產(chǎn)物在MiSeqPE300平臺上進(jìn)行雙端測序。美吉平臺MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先用QIIME(v1.9.1)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理獲得合格的reads，根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成1條序列，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

樣品數(shù)據(jù)采用稀釋曲線分析、可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)分析以及β多樣性分析，運(yùn)用Excel繪制OTU水平上樣本菌群分布群落Bar圖，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件 Geneious Prime(v2021.1.1)進(jìn)行細(xì)菌序列的比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品16S rRNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增電泳結(jié)果

酸奶樣品總DNA經(jīng)酶標(biāo)儀檢測后，濃度均在10～15 ng/μL，且OD260/OD280均在1.8～2.0，表明DNA純度較高。圖1為樣品16S rRNA V3～V4區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析結(jié)果，選用100 bp ladder為Marker。16個樣品在目標(biāo)產(chǎn)物區(qū)域均出現(xiàn)明顯的條帶，而陰性對照無條帶，說明酸奶樣品中存在細(xì)菌。此外16個樣品的電泳條帶均勻單一，表明PCR擴(kuò)增成功，可以進(jìn)行后續(xù)的測序。

M-marker
圖1 16S rRNA V3～V4區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳
Fig.1 The agarose gel electrophoresis of PCR products from V3～V4 region of 16S rRNA
注：N1、N2分別為提取DNA時采用的陰性對照和PCR擴(kuò)增時采用的陰性對照

2.2 稀釋曲線

圖2為樣品OTU稀釋曲線，反映群落豐富度的指數(shù)有Sobs、Chao、Ace、Jack、Bootstrap等，其中Sobs描述豐富度實(shí)際觀測值，更能直觀體現(xiàn)本研究樣品的豐富度，因此采用的多樣性指數(shù)為Sobs。由圖2可知，隨著測序深度增加，曲線趨于平坦，更多的測序量并不會產(chǎn)生更多的物種。表明測序深度合理，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 稀釋曲線
Fig.2 Rarefraction curve

2.3 OTU分類

按照序列間相似度97%為閾值對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，去除嵌合體，測序結(jié)果顯示，酸奶樣品中的細(xì)菌一共包含16個OTU序列。根據(jù)分類學(xué)分析各分類水平(域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU)上的物種組成情況，如表2所示。OTU水平上樣本菌群分布群落條形圖如圖3所示。

2.3.1 發(fā)酵菌種

本研究采集的樣品共鑒定出9種發(fā)酵菌種，包括OTU1(Streptococcus thermophiles)、OTU2(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)、OTU3(uncultured Streptococcus)、OTU4(Lactococcus lactis)、OTU5(Lactobacillus acidophilus)、OTU6(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、OTU9(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)、OTU13(Lactococcus piscium)和OTU14(Lactiplantibacillus plantarum)。

根據(jù)調(diào)查顯示，市面上采用的發(fā)酵菌種大多為乳酸菌，乳酸菌包括嗜熱鏈球菌屬、雙歧桿菌屬，乳酸球桿菌屬、乳酸鏈球菌屬、保加利亞乳桿菌屬、嗜酸桿菌等，不同型號的酸奶根據(jù)需求對發(fā)酵菌種進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在所有樣品中均檢測到了嗜熱鏈球菌，且在各樣品中最為豐富。

2.3.2 污染菌

此外，鑒定出4種污染細(xì)菌，即OTU7(Anoxybacillus flavithermus)、OTU10(Acinetobacter baumannii)、OTU11(Enterobacter sp.)和OTU15(Arthrobacter sp.)。

其中OTU10和OTU11可能為條件致病菌，由圖3-b可知，OTU10主要存在于D和F樣品中，而OTU11存在于F和A3樣品中。鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，可引起免疫缺陷宿主的機(jī)會性感染，感染后具有很高的死亡率。大腸桿菌為腸桿菌屬中主要的細(xì)菌，大腸桿菌的分布廣泛，在各種動物和食物中較容易被檢出，大多不會引發(fā)疾病，但一些特殊血清的大腸桿菌具有一定的致病性。

OTU7和OTU15可能造成酸奶的腐敗變質(zhì)。OTU15少量存在于A1與A3中，OTU7在樣品A、D和A3中豐度較高。節(jié)桿菌屬是最常見的分離細(xì)菌，常見于土壤和被工業(yè)化學(xué)品和放射性材料污染的環(huán)境中[8]。OTU7是常見的腐敗微生物之一，研究表明產(chǎn)芽孢嗜熱細(xì)菌屬的地桿菌和無氧桿菌是乳品工業(yè)中常見的污染物[9]。此外，OTU12的序列沒有檢索到可信度更高的物種信息，可能為不可培養(yǎng)的污染菌，在A8中豐度較高，在G、A2和A4中少量存在。

除了這些細(xì)菌之外，OTU8與OTU16不是細(xì)菌序列，而是屬于植物界中的李屬，從圖3-b可知，這兩種均出現(xiàn)在A2樣品中，該樣品為黃桃果粒風(fēng)味發(fā)酵乳，推斷它們是由酸奶中的黃桃果醬等輔料帶入的。

2.4 主成分分析

圖4為主成分分析(principal component analysis，PCA)，通過比較不同樣本中細(xì)菌群落的組成來反映酸奶樣本間的差異，樣本物種組成越相似，其在PCA圖中的距離越近。A與A5為平行酸奶樣品，從圖4可知，兩者的測序結(jié)果基本一致；而不同品牌的酸奶樣品之間差異較大，尤其是B樣品。B樣品中含有大量的OTU2，故與其他樣品產(chǎn)生了較大的差異。

表2 OTU序列物種分類
Table 2 The classification of species represented by OTU

注：“/”表示未查到

圖3 基于屬水平15個OTU的菌種組成分析
Fig.3 Bacterial composition analysis based on 15 OTU at the genus level
注：由于OTU1相較于其他16種OTU來說數(shù)量過大，無法顯著
呈現(xiàn)出其他物種的豐富度。因此圖3將OTU1去掉，為充分呈現(xiàn)出樣品
之間的物種豐富度差異

圖4 不同酸奶樣品細(xì)菌菌群的主成分分析
Fig.4 Principal component analysis of bacterial community of different yogurt samples

2.4.1 不同品牌酸奶

樣品A、B、C、D、E、F、G和H分別來自8個不同品牌，這8種樣品均為以生牛乳為原料，不添加其他成分的原味風(fēng)味發(fā)酵乳。結(jié)果表明，B、C、E、G和H品牌酸奶中沒有背景細(xì)菌(即酸奶中除了人為添加的發(fā)酵菌種以外的細(xì)菌統(tǒng)稱為背景細(xì)菌)，可初步判斷為安全性較高的酸奶。而在A、D和F樣品中，A存在較多的OTU7；D相較于A樣品，除了含有OTU7之外，還存在較多OTU10；F主要存在OTU10。

由結(jié)果可知，這8個品牌的酸奶品質(zhì)并不相同，存在品牌之間的差異。所產(chǎn)生的差異可能是由于發(fā)酵劑、生產(chǎn)工藝等因素不同所致。

2.4.2 同種品牌不同型號酸奶

此外，對A品牌旗下的不同系列的酸奶樣品也進(jìn)行了研究。其中A2樣品為復(fù)原乳酸奶，且A2與A3樣品中均添加了黃桃果醬，其余均為原味發(fā)酵乳。結(jié)果表明，A6與A7中背景細(xì)菌數(shù)量相對較少，A2、A4次之；A2中出現(xiàn)OTU8與OTU16兩種非細(xì)菌序列的污染物，可能是取樣時黃桃果醬偶然帶入所致；A3樣品中主要含有OTU11。A1、A5與A8均含有較多的OTU7。

結(jié)果表明同一品牌下的酸奶之間亦存在差異性。導(dǎo)致差異性的原因主要有3點(diǎn)：原料乳不同，分為生牛乳和復(fù)原乳兩種；發(fā)酵菌種不同；添加的輔料不同，添加果粒會對酸奶的菌群造成影響。

3 討論

3.1 商品化酸奶中發(fā)酵菌種的篩查

經(jīng)比對分析，部分樣品中的發(fā)酵菌與表1中標(biāo)簽所示完全一致，而部分樣品不完全一致。對此，分析有3點(diǎn)原因：其一，該商品化酸奶中實(shí)際添加的發(fā)酵菌種與標(biāo)簽不符。根據(jù)GB 7718—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》，標(biāo)簽內(nèi)容需確保真實(shí)，因此標(biāo)簽所示發(fā)酵菌種均按要求添加；其二，樣品中均按標(biāo)簽添加了發(fā)酵菌種，但由于某些乳酸菌屬菌株之間的16S rRNA V3～V4區(qū)序列相似度較高，因此被歸類于同一OTU而沒有被區(qū)分開。經(jīng)生物信息學(xué)軟件Geneious Prime進(jìn)行序列比對后，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬的各個菌種之間16S rRNA V3～V4區(qū)相似度較高，且該區(qū)域片段長度有限(僅400～500 bp左右)，無法把某些菌種完全區(qū)分，因此某些乳酸菌種可能被歸類于乳桿菌屬；其三，某些發(fā)酵菌種添加量比較少，在后續(xù)加工和貯運(yùn)環(huán)節(jié)中菌株失活甚至DNA降解，故未完全被檢測出。

3.2 酸奶中背景細(xì)菌的溯源及防控

本研究是檢測酸奶樣品中細(xì)菌的DNA，因此不能區(qū)分菌株是否為存活的狀態(tài)，只能說明背景細(xì)菌曾經(jīng)在酸奶中存在過。背景細(xì)菌的存在，可能導(dǎo)致一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)，因此從以下3個方面對其進(jìn)行溯源分析。

(1)原料乳的質(zhì)量：影響原料乳質(zhì)量的因素包括奶牛乳房炎、奶牛飲食、養(yǎng)殖環(huán)境、擠奶過程及原奶的運(yùn)輸過程。我國導(dǎo)致奶牛乳房炎最主要細(xì)菌是金黃色葡萄球菌和鏈球菌，發(fā)病率高達(dá)80%[23]。原料乳中曾檢測到不動桿菌屬，表明OTU10可能來自于患有乳房炎乳奶牛的原料乳中。此外，F(xiàn)ERNANDO等[24]從奶牛糞便存儲池和地表水中分離回收到鮑氏不動桿菌，曹慧慧等[25]在奶牛養(yǎng)殖場采集原料乳的環(huán)節(jié)檢測到不動桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、棒狀桿菌屬等。這些環(huán)節(jié)均可導(dǎo)致OTU10、OTU11與OTU15混入。

(2)酸奶生產(chǎn)加工過程：酸奶的加工過程包括配料、預(yù)熱、均質(zhì)、殺菌、接種、發(fā)酵、攪拌、后熟以及包裝和運(yùn)輸，其中復(fù)原乳酸奶還包括奶粉生產(chǎn)加工過程。污染細(xì)菌可能來源于生產(chǎn)器械、加工人員、果醬輔料等。COLERI CIHAN等[26]相關(guān)研究表明，OTU7有形成生物膜的潛力使其殘存于加工器械上。

(3)包裝運(yùn)輸：包裝材料的質(zhì)量、包裝環(huán)境也會對酸奶質(zhì)量產(chǎn)生影響，對此可采用紫外滅菌等預(yù)處理保證其無菌狀態(tài)。酸奶大多采用冷鏈運(yùn)輸，若在運(yùn)輸過程中溫度控制不當(dāng)，可能會造成酸奶腐敗變質(zhì)。

3.3 與國家標(biāo)準(zhǔn)對比

在本研究中發(fā)現(xiàn)的7種背景細(xì)菌只有腸桿菌屬在國標(biāo)中有明確的規(guī)定，雖然本實(shí)驗(yàn)只對酸奶樣品中的細(xì)菌進(jìn)行定性分析，但在F和A3樣品中檢出腸桿菌，說明商品化的酸奶樣品仍然存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。同時，酸奶國家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于細(xì)菌部分是基于培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測的，大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌無法有效檢出，因此測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的部分難以培養(yǎng)細(xì)菌也可能存在潛在的隱患。隨著現(xiàn)代高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，酸奶中微生物尤其是細(xì)菌的檢測和篩查有待進(jìn)一步的提高和完善。

4 結(jié)論

綜上所述，本文通過宏基因組測序法分析8個品牌16種低溫酸奶樣品中的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)不同品牌和同一品牌的不同種類酸奶之間均存在顯著性差異。除了發(fā)酵劑中的乳酸菌之外，在商品化酸奶樣品中還發(fā)現(xiàn)了部分環(huán)境污染細(xì)菌，表明商品化酸奶在原料乳收集、加工生產(chǎn)和包裝運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)仍然存在受環(huán)境細(xì)菌污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究成果為商品化酸奶細(xì)菌群落研究和提高酸奶安全性提供一定的參考價值。