體外消化和結(jié)腸發(fā)酵對蜂花粉酚類化合物及抗氧化活性的影響

蜂花粉是蜜蜂通過采集顯花植物的花粉，并添加花蜜等物質(zhì)后形成的顆粒物，富含多酚、纖維素等物質(zhì)，在我國作為保健食品已有幾百年的歷史。蜂花粉中的酚類化合物可以清除自由基，從而改善氧化應(yīng)激對機(jī)體造成的危害，如炎癥、心血管疾病和癌癥等，因此蜂花粉多酚的吸收和利用與人體的健康息息相關(guān)[1]。

生物有效性指數(shù)是用來評估從食物中釋放出來可以被人體吸收的化合物的量[2]，因此要提高多酚在體內(nèi)的利用率就必須提高其生物有效性。根據(jù)溶解度可將多酚分為兩類：通過有機(jī)溶劑提取的可溶性游離態(tài)多酚，和保留在剩余殘?jiān)械牟豢扇苕I合態(tài)多酚。膳食攝入的游離態(tài)多酚不到膳食總酚的10%，大部分鍵合多酚以共價鍵結(jié)合在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分上，不能被胃和小腸消化，只有在腸道微生物作用下才能從食物基質(zhì)中釋放出來，從而被人體吸收利用[3]。另一方面，花粉粒外壁較厚，而且對酸、堿等理化因素有一定的耐受性，因此不利于多酚等營養(yǎng)物質(zhì)的釋放。有研究表明，通過某些微生物對蜂花粉進(jìn)行發(fā)酵，不僅能達(dá)到破壁的目的，還能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放，提高其生物有效性[4]。因此，腸道微生物對蜂花粉的作用可能是蜂花粉在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前尚未有這方面的研究。

體外消化和結(jié)腸發(fā)酵模型廣泛應(yīng)用于研究食物和藥物在體內(nèi)的吸收和利用情況，與體內(nèi)模型相比，體外實(shí)驗(yàn)不僅沒有道德爭議，而且重現(xiàn)性高、簡便易行，能夠更加客觀系統(tǒng)地評估營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)各個階段的生物有效性[5]。體外消化一般是指胃和腸消化，該過程模擬了體內(nèi)生理?xiàng)l件，如消化時間、溫度、pH值、酶的種類及其濃度、鹽濃度等[6]，這些條件均會對營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生影響。體外結(jié)腸發(fā)酵一般是利用人類糞菌對體外消化后的殘余物進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)從食物基質(zhì)中釋放，提高營養(yǎng)物質(zhì)的生物有效性。許多研究者通過體外模型研究食物基質(zhì)中酚類化合物的生物有效性，發(fā)現(xiàn)角豆粉[7]、堅(jiān)果[8]經(jīng)結(jié)腸發(fā)酵后，其抗氧化活性以及生物有效性得到較大提高。蜂花粉中含有豐富的酚類物質(zhì)，如山奈酚、柚皮素、沒食子酸等[9]，但目前尚未有文獻(xiàn)通過體外模型研究不同蜂花粉酚類化合物的生物有效性。因此，本研究以油菜蜂花粉、茶花粉、五味子蜂花粉為原料，研究3種蜂花粉在不同消化階段以及發(fā)酵時間總酚、總黃酮和抗氧化活性的變化規(guī)律，并進(jìn)一步分析其生物有效性，為開發(fā)新型蜂花粉功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉均購自蜂農(nóng)處，并通過孢粉學(xué)鑒定植物源[10]，以確定3種蜂花粉的種類。

α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽鹽，上海阿拉丁生化科技有限公司；DPPH、沒食子酸、福林酚、FeSO4·7H2O、CaCl2·6H2O、MnSO4·H2O、CoCl2·6H2O、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、NiCl2、CuSO4·5H2O 等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

200T粉磨機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；NDK200-1氮吹儀，上海皓莊儀器有限公司；CXG-1微生物培養(yǎng)箱，上海青浦滬西儀器廠；UV1800分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司制造；52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海佑科儀器有限公司；SHA-B恒溫?fù)u床，常州國華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉除雜，磨粉過50目篩，密封貯存于-20 ℃。

1.3.2 蜂花粉總可溶酚類化合物的提取

參照陳壁等[11]的方法，分別稱取2.4 g 3種蜂花粉粉末，用70%(體積分?jǐn)?shù))丙酮超聲提取20 min后離心，取上清液，即為總可溶多酚化合物。

1.3.3 體外模擬胃腸消化

參照GULLON等[12]的方法，先進(jìn)行胃消化，再將胃消化后的殘余物進(jìn)行腸消化。用1 mmol/L CaCl2配制的100 U/mL α-淀粉酶溶液，用5 mL 0.1 mol/L HCl溶解0.06 g胃蛋白酶配制胃消化液；用5 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液溶解250 mg膽鹽配制膽汁溶液，用5 mL 0.5 mol/L NaHCO3溶液溶解0.04 g胰蛋白酶并與1.2 mL膽汁溶液混勻配制腸消化液。

模擬胃消化：分別稱取2.4 g 3種蜂花粉粉末，依次加入1 ml配制好的α-淀粉酶溶液、9 mL蒸餾水，混合均勻后，于37 ℃恒溫振搖2 min。然后用6 mol/L HCl將3種蜂花粉懸液調(diào)至pH 2，分別與1 mL模擬胃液混合均勻，于37 ℃恒溫振搖消化2 h。模擬胃腸消化：用6 mol/L NaOH將3種蜂花粉胃消化后的懸濁液調(diào)至pH 7，分別加入2.4 mL模擬腸液混合均勻，于37 ℃恒溫振搖消化2 h。模擬小腸吸收：將模擬體外消化結(jié)束后的3種蜂花粉懸濁液于37 ℃，10 mmol/L NaCl 溶液中透析過夜(3 kDa)。

1.3.4 體外模擬結(jié)腸發(fā)酵

選擇3名3個月內(nèi)未服用過任何抗生素的健康成年人作為新鮮糞便提供者，糞便樣品以質(zhì)量比1∶1∶1混合，依據(jù)MOSELE等[13]的方法配制腸道發(fā)酵菌液，貯存于-20 ℃?zhèn)溆茫?7 ℃恒溫解凍后使用。其中發(fā)酵菌液的配制要在1 h內(nèi)完成。參考LEBET等[14]方法配制體外發(fā)酵培養(yǎng)液。將經(jīng)過模擬體外消化和小腸吸收后的殘余物與體外發(fā)酵培養(yǎng)液、腸道發(fā)酵菌液以1∶2∶2的比例混合均勻，充氮?dú)? h，在37 ℃厭氧條件下分別培養(yǎng)0、3、6、12、24 h。

1.3.5 多酚提取以及生物有效性

收集體外消化以及結(jié)腸發(fā)酵各個階段的上清液，用乙酸乙酯萃取后真空旋干，甲醇定溶，于-20 ℃冰箱貯存，用于測定各項(xiàng)指標(biāo)，并按照公式(1)計(jì)算生物有效性：

生物有效性

(1)

式中：PCA(polyphenolic compounds content in samples after in vitro digestion or colonic fermentation)：不同體外消化階段或不同結(jié)腸發(fā)酵時間樣品中酚類物質(zhì)的量；PCB(polyphenolic compounds content in samples before in vitro digestion)：體外消化之前樣品中酚類物質(zhì)的量。

1.3.6 總酚含量測定

總酚含量測定參考BOUAYED等[15]的方法，以沒食子酸(gallic acid equivalents，GAE)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果用沒食子酸當(dāng)量來表示，結(jié)果表示為mg GAE/g樣品。

1.3.7 總黃酮含量測定

總黃酮含量測定參考BLASA等[16]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果用蘆丁當(dāng)量(rutin equivalents，RE)表示，結(jié)果表示為mg RE/g樣品。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的測定

參考JAYAPRAKASHA等[17]的方法并經(jīng)適當(dāng)修改，利用維生素C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取適量樣品溶液與4 mL 0.04 mg/mL DPPH的甲醇溶液充分混合后，避光反應(yīng)并測定吸光度，DPPH自由基清除能力以每克樣品中相當(dāng)于維生素C的物質(zhì)的量表示，單位為mg維生素C/g樣品。

1.3.9 鐵離子還原力測定

參考ULUSOY等[18]的方法并經(jīng)適當(dāng)修改。取適量樣品溶液與4 mL 2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4, 6-tripyridyl triazine，TPTZ)工作液混合，于37 ℃水浴10 min，在593 nm處測定吸光度。結(jié)果表示為mg Trolox/g樣品。

1.3.10 亞鐵離子絡(luò)合力測定

參考SINGH等[19]的方法對樣品的亞鐵離子絡(luò)合能力進(jìn)行了測定。取適量樣品溶液與100 μL 1 mmol/L FeSO4、300 mL 1 mmol/L鐵試劑混合，用甲醇定容至1 mL，在562 nm處測量吸光度。結(jié)果以每克樣品相當(dāng)于乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA)的質(zhì)量來表示，單位為mg Na2EDTA/g樣品。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均測定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Tukey多重比較，對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)；運(yùn)用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化過程中3種蜂花粉酚類化合物含量及其抗氧化活性

蜂花粉的抗氧化活性與酚類化合物的含量有關(guān)，其抗氧化活性可能會因胃腸消化過程中的環(huán)境不同而發(fā)生變化[20]。另外，由于食品的抗氧化活性是由多種反應(yīng)機(jī)理決定的，因此本文結(jié)合多種方法來測定蜂花粉體外消化各階段的抗氧化能力。由表1可以看出，3種蜂花粉未消化階段的總酚、總黃酮含量均高于體外消化階段，這可能是由于體外消化階段測定的是消化后樣品的上清液，而未消化階段測定的是蜂花粉樣品的總可溶性多酚。SHU等[21]在研究茶粉多酚的體外消化特性時發(fā)現(xiàn)，未消化比消化過的樣品呈現(xiàn)出更高的抗氧化活性，該研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。ARGYRI等[22]發(fā)現(xiàn)酚酸、類黃酮等酚類化合物的溶解性和可利用性受到pH條件以及與膳食成分(如鐵、纖維或蛋白質(zhì))相互作用的影響。經(jīng)過體外消化后，蜂花粉中酚類化合物在酸堿環(huán)境和消化酶作用下從基質(zhì)中釋放出來。由表1可知，茶花粉的多酚溶出量最多，在胃消化和胃腸消化結(jié)束后酚類物質(zhì)的含量分別是2.76、2.69 mg/g。這可能是茶花粉中可溶性游離態(tài)酚類化合物含量較高，易于溶出，而五味子蜂花粉、茶花粉中不可溶性結(jié)合態(tài)酚類化合物含量較高，對胃腸消化液的抵抗力較強(qiáng)。與胃消化相比，3種蜂花粉經(jīng)過模擬胃腸消化后酚類化合物的含量均降低。這一結(jié)果與鄭慧等[23]研究一致，蜂花粉經(jīng)模擬胃腸消化后酚類物質(zhì)的含量降低，這可能是由于腸道的溶解氧和堿性環(huán)境引起了兒茶素等酚類物質(zhì)的自氧化[24]。事實(shí)上，在胃腸消化條件下不同酚類化合物的穩(wěn)定性不同。李俶等[25]研究了體外模擬消化對7種酚類物質(zhì)穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過胃消化后兒茶素和表兒茶素的含量分別降低了16.6%和6%；經(jīng)過胃腸消化后，只有阿魏酸的含量略有上升，其余酚類化合物的含量均呈降低趨勢，其中沒食子酸下降了71%，綠原酸下降了35%。有研究顯示，油菜蜂花粉、五味子蜂花粉、茶花粉均含有豐富的沒食子酸、對羥基苯甲酸、鞣花酸等酚類化合物[9]，這可能是3種蜂花粉多酚在胃腸消化階段不穩(wěn)定的原因。

表1 體外消化后蜂花粉中酚類化合物含量以及抗氧化活性 單位：mg/g

Table 1 Phenolic compounds contents and antioxidant activities of bee pollen after digestion in vitro

注：表中不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 體外結(jié)腸發(fā)酵過程中3種蜂花粉酚類化合物和抗氧化活性

由圖1可知，在模擬體外結(jié)腸發(fā)酵過程中，隨發(fā)酵時間的延長，3種蜂花粉中總酚和總黃酮含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)。結(jié)腸發(fā)酵24 h時，3種蜂花粉的總酚含量分別達(dá)到5.99、7.17、6.38 mg/g，總黃酮含量分別達(dá)到4.27、4.62、3.68 mg/g；與發(fā)酵0 h相比，3種蜂花粉的總酚含量分別提高了67.75%、70.11%、75.31%，總黃酮含量分別提高74.55%、80.96%、78.52%，其中五味子蜂花粉在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中釋放的酚類物質(zhì)最多。這可能是由于在結(jié)腸微生物發(fā)酵的過程中，蜂花粉中的鍵合態(tài)多酚與細(xì)胞壁成分相連接的共價鍵、氫鍵和疏水鍵在微生物和酶的作用下發(fā)生斷裂，這些多酚以可溶性游離態(tài)的形式釋放出來，導(dǎo)致酚類化合物的含量提高[26]。DONG等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與體外消化相比，結(jié)腸發(fā)酵顯著釋放并轉(zhuǎn)化了大量胡蘿卜結(jié)合態(tài)多酚，微生物途徑可能是對羥基苯甲酸、阿魏酸、沒食子酸和原兒茶酸等26種酚類物質(zhì)釋放及代謝的主要途徑。除此以外，結(jié)腸發(fā)酵過程中酚類化合物含量的增加可能還與微生物發(fā)酵促進(jìn)蜂花粉破壁有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、酵母菌、植物乳桿菌、保加利亞桿菌等均可以通過發(fā)酵作用使蜂花粉破壁，并促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放[4]。

a-多酚含量；b-黃酮含量
圖1 體外結(jié)腸發(fā)酵后蜂花粉中總酚和總黃酮的含量
Fig.1 The total phenolic content and total flavonoids content of bee pollen after colonic fermentation in vitro
注：圖中相同樣品肩標(biāo)不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖2可以看出，在體外結(jié)腸發(fā)酵的24 h過程中，3種蜂花粉的鐵離子還原力、亞鐵離子絡(luò)合力、DPPH自由基清除力均呈逐漸增加的趨勢，這與3種蜂花粉在發(fā)酵過程中酚類化合物含量增加有關(guān)。結(jié)腸發(fā)酵24 h時，與發(fā)酵0 h相比，3種蜂花粉的鐵離子還原力分別提高了49.38%、59.31%、60.91%；3種蜂花粉對亞鐵離子的絡(luò)合力分別提高了69.33%、71.69%、84.93%；3種蜂花粉的DPPH自由基清除能力分別提高了69.47%、73.57%、68.57%。研究發(fā)現(xiàn)，對青稞進(jìn)行體外結(jié)腸發(fā)酵前30 h內(nèi)，酚類化合物含量與抗氧化活性顯著升高[28]，巴西莓的抗氧化活性在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中也呈逐漸升高的趨勢[29]，這與我們的研究結(jié)果一致。胃腸系統(tǒng)由于經(jīng)常暴露于活性氧(reactive oxygen species，ROS)和源于飲食的病原體自由基中，從而發(fā)生過度氧化應(yīng)激反應(yīng)[30]，膳食攝入的多酚等抗氧化劑可以中和氧自由基，緩解由氧化應(yīng)激引起的胃腸疾病。由圖2可知，與體外消化相比，結(jié)腸發(fā)酵顯著提高了3種蜂花粉的抗氧化能力，因此，腸道微生物對蜂花粉多酚的作用，可能是蜂花粉攝入后能夠緩解胃腸疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

a-鐵離子還原力；b-亞鐵離子絡(luò)合力；c-DPPH自由基清除力
圖2 體外結(jié)腸發(fā)酵后蜂花粉中酚類化合物的抗氧化活性
Fig.2 Antioxidant activities of phenolic compounds in bee pollen after colonic fermentation in vitro

2.3 體外胃腸消化及結(jié)腸發(fā)酵過程中3種蜂花粉酚類化合的生物有效性

食物中多酚等生物活性物質(zhì)含量的測定通常經(jīng)過化學(xué)試劑提取后進(jìn)行，但所有生物活性物質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功效前都會受多種因素的影響，如食物基質(zhì)、胃腸道的酸堿環(huán)境、酶、腸道微生物等，因此通過體外模型計(jì)算生物有效性才能更加客觀的評估人體實(shí)際利用的活性物質(zhì)的量。由表2～表4可以看出，3種蜂花粉總酚、總黃酮以及抗氧化活性的生物有效性在體外消化和結(jié)腸微生物發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，其中在模擬小腸吸收后(發(fā)酵0 h)達(dá)到最低，在結(jié)腸發(fā)酵過程中逐漸升高。結(jié)腸發(fā)酵24 h時，3種蜂花粉多酚生物有效性均超過未消化時生物有效性，分別達(dá)到126.96%、139.74%、120.54%，與發(fā)酵0 h相比，分別提高了67.87%、73.01%、75.36%。實(shí)際上，存在于食物和草藥當(dāng)中的天然酚類物質(zhì)主要與糖和有機(jī)酸如奎尼酸結(jié)合，以縮合單寧等低聚物的形式存在。這些縮合物吸收不良或者根本不能被小腸吸收，需要在腸道微生物的作用下水解(脫糖基和酯水解)、裂解(碳環(huán)裂解；去脂化、去甲基化)和還原(脫羥基化和雙鍵還原)成更多生物可利用的小分子代謝物，從而提高生物利用率[31]。因此，為了提高蜂花粉多酚的生物利用率，可以通過體外益生菌發(fā)酵來輔助蜂花粉酚類物質(zhì)的釋放。

表2 體外消化及結(jié)腸發(fā)酵后油菜蜂花粉中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性 單位：%

Table 2 Bioavailability of phenolic compounds and antioxidant activities of rape bee pollen after digestion and colonic fermentation in vitro

表3 體外消化及結(jié)腸發(fā)酵后五味子蜂花粉中酚類化合物和抗氧化活性生物有效性 單位：%

Table 3 Bioavailability of phenolic compounds and antioxidant activities of Schisandra chinensis bee pollen after digestion and colonic fermentation in vitro

表4 體外消化及結(jié)腸發(fā)酵后茶花粉中酚類化合物和抗氧化活性生物有效性 單位：%

Table 4 Bioavailability of phenolic compounds and antioxidant activities of Camellia japonica bee pollen after digestion and colonic fermentation in vitro

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，3種蜂花粉經(jīng)體外模擬胃腸消化后，多酚生物有效性分別達(dá)到47.16%、45.59%、50.75%，在體外結(jié)腸發(fā)酵24 h過程中，總酚、總黃酮含量以及抗氧化活性顯著提高，多酚的生物有效性達(dá)到126.96%、139.74%、120.54%。這可能是由于蜂花粉中含有大量不可溶性鍵合態(tài)酚類物質(zhì)，能抵抗胃腸消化液作用，而在結(jié)腸微生物的發(fā)酵作用下大量釋放。此外，不同種類蜂花粉在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中多酚的釋放量不同，在3種蜂花粉中，五味子蜂花粉在結(jié)腸微生物發(fā)酵的作用下釋放的總酚、總黃酮的量最高，因此其抗氧化活性最高。研究結(jié)果表明，結(jié)腸發(fā)酵可以釋放鍵合態(tài)多酚以提高酚類化合物的生物有效性，是蜂花粉多酚在體內(nèi)發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該研究為開發(fā)蜂花粉抗氧化功能性食品提供理論依據(jù)。