混菌發(fā)酵制備茶籽多肽及其抗氧化作用

小分子多肽是蛋白質不完全水解后產(chǎn)生的由不同氨基酸組成的多肽鏈的通稱，相對分子質量在5 000以下，具有比原料蛋白及氨基酸混合物更優(yōu)越的食品加工性能及營養(yǎng)價值，也被稱為“生物活性肽”。多肽相比蛋白質更易吸收，同時具有降膽固醇、降血壓、抗菌、抗氧化等生物活性，廣泛應用于醫(yī)藥、保健、食品、化妝品等行業(yè)[1-2]。多肽的制備可采用酸堿水解、微生物發(fā)酵轉化及蛋白酶水解等方法，發(fā)酵法制備生物活性肽正成為肽制備工藝的研究熱點[3]。該方法利用單菌或混菌微生物生長過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白原料，通過對發(fā)酵過程的控制，定向產(chǎn)生具有特定生物功能的小分子多肽產(chǎn)物，具有成本低、無污染等特點。眾多學者在發(fā)酵菌種選育、發(fā)酵過程控制等方面開展了研究，已成功開發(fā)出大豆肽[4]、花生肽[5]、紫蘇肽[6]、榛仁肽[7]等多種生物活性肽。衰老、炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)病機理與體內(nèi)自由基過多或清除自由基能力下降有密切關系。植物蛋白來源的天然抗氧化肽多樣性廣、生物安全性高，在功能性食品、生物醫(yī)藥開發(fā)領域具有廣闊的應用前景?？寡趸钚栽u價方法較多，其中ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基(·OH)被廣泛用于抗氧化多肽的自由基清除能力評價[8-10]。根據(jù)自由基類型、自由基清除機制的不同，以上三者可分別評估脂溶性、水溶性抗氧化劑的氮、氧自由基的清除能力，綜合采用以上3種測定方法可彌補單一方法的不足，更科學、全面地評價多肽抗氧化能力[11]。

茶籽是山茶科植物茶的果實，是茶葉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，除部分可留作茶樹有性繁殖種子及壓榨茶油外，目前尚無成熟的利用途徑，被散落在茶園中，任其自然腐化。茶籽中富含10%～15%的茶皂素、10%～20%的蛋白質、30%～50%的糖類物質和一定量的多酚類物質。茶葉源蛋白、茶籽源多肽的研究及產(chǎn)品開發(fā)是繼茶皂素、茶多酚、茶多糖等活性成分之后又一新熱點[12-13]。現(xiàn)已相繼證實了茶葉、茶渣、茶籽中的蛋白質組分及其多肽水解產(chǎn)物不同程度上具備抗氧化活性[14-15]、血管緊張素轉換酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE)抑制活性[16]、降糖活性[17]。相對大豆、花生、玉米等來源的多肽而言，茶籽源多肽的制備及產(chǎn)品開發(fā)目前尚處在分離提取及活性評價的初級研究階段。

本研究以茶籽為原料，采用兩段順序發(fā)酵工藝，首先以白腐真菌靈芝菌的菌絲體增殖對茶籽原料中的蛋白質組分進行有效釋放，進而以解淀粉芽孢桿菌完成茶籽蛋白的生物轉化，制備茶籽多肽。基于Plackett-Burman(PB)試驗設計獲得影響多肽產(chǎn)量的顯著因子后，設計多因素響應面試驗，得到茶籽多肽的最佳發(fā)酵工藝。并對發(fā)酵后產(chǎn)物進行超濾分離及抗氧化活性分析，為茶葉籽、油茶籽、油茶餅粕資源的高值化利用及茶籽多肽產(chǎn)品開發(fā)提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶籽原料采自安徽宣城地區(qū)的秋季茶園，經(jīng)干燥、脫殼、粉碎預處理后，備用；靈芝菌(Ganoderma lucidum UIM-281)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens PI142)為本實驗室前期誘變選育的保存菌種，分別具備木質素分解能力及蛋白酶分泌能力。

靈芝菌增殖培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基；解淀粉芽孢桿菌增殖培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基;混菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：茶籽粉70 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 L，pH 8.0。

1.2 試劑與設備

DPPH、ABTS、牛血清白蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水乙醇等均為分析純，國藥試劑。Multiskan FC酶標儀，賽默飛世爾儀器有限公司；TGL-16A高速冷凍離心機，湖南湘儀；WKF-180高速粉碎機，淄博史克制藥設備有限公司；ZQZY-78BV恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵劑制備

靈芝菌種子培養(yǎng)：從保存的平板上，切取直徑1 cm的UIM-281菌絲1塊，打散后接入PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72 h，作為種子液。解淀粉芽孢桿菌種子培養(yǎng)：從保存的菌種斜面挑取1環(huán)PI142接至含30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，作為PI142種子液。

1.3.2 混菌兩段發(fā)酵工藝流程

混菌兩段發(fā)酵工藝流程如下：

茶籽預處理(干燥、脫殼、粉碎至60目)→發(fā)酵培養(yǎng)基調配(主料茶籽、輔料葡萄糖)→接種UIM-281(裝液量100 mL/250mL)→Ⅰ段發(fā)酵→接種PI142→Ⅱ段發(fā)酵→離心(10 000 r/min，10 min)→取上清液、粗分離→茶籽多肽

1.3.3 混菌發(fā)酵培養(yǎng)條件主效應因子篩選

基于前期UIM-281、PI142單因素發(fā)酵試驗結果，設計Plackett-Burman試驗對影響茶籽多肽產(chǎn)量的眾多因素進行顯著性篩選。入選的因素為：主料茶籽粉、輔料葡萄糖、UIM-281接種量、初始pH、Ⅰ段發(fā)酵溫度、Ⅰ段發(fā)酵時間、PI142接種量、Ⅱ段發(fā)酵溫度、Ⅱ段發(fā)酵時間、搖床轉速。每個因素取高(+1)、低(-1)兩水平。基于PB試驗結果，設計最陡爬坡實驗，對主效應因子進行水平尋優(yōu)。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗結果，選取主效應因子為自變量，以多肽產(chǎn)量為響應值，設計三因素三水平響應面試驗。

1.3.5 多肽含量測定

多肽含量以酸可溶性多肽計，采用三氯乙酸法測定。

標準曲線制作：標準曲線采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白的質量濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，制作標準曲線y=0.009 5x+0.108 7，R2=0.998 9。

樣品測定：發(fā)酵液經(jīng)離心分離后，取5 mL上清液，加入5 mL 質量分數(shù)10%的三氯乙酸，充分混勻后，靜置10 min，8 000 r/min離心10 min，去除大分子蛋白，取上清液，采用雙縮脲法測定多肽含量，代入標準曲線，計算多肽含量。

1.3.6 茶籽多肽粗分離

發(fā)酵液經(jīng)固-液離心分離后，上清液加入2倍體積的無水乙醇，靜置沉淀12 h后，8 000 r/min離心10 min，去除大分子蛋白、多糖等組分；對離心后的上清液，采用杯式超濾器，選擇截留分子質量5、1 kDa的平板式超濾膜片在流速10 mL/h、壓力0.3 MPa條件下對小分子多肽組分進行粗分離，獲得分子質量1～5 kDa的肽段(Ts)，測定其抗氧化活性。以未經(jīng)接種發(fā)酵的茶籽培養(yǎng)基上清液(T0)為對照；L-抗壞血酸(維生素C)為陽性對照。

1.3.7 ABTS陽離子自由基清除率測定

參考郝金斌等[8]的方法稍加修改，將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫下暗處放置12～16 h，將其用無水乙醇稀釋成在734 nm處吸光值達到0.7±0.02，得ABTS陽離子溶液。將200 μL不同濃度的樣品液與800 μL ABTS陽離子溶液充分混勻，置于暗環(huán)境準確計時6 min，在734 nm處測吸光值， ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(1)所示。以與樣品同一質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照，以質量濃度與ABTS陽離子自由基清除率之間做回歸方程并且計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

ABTS陽離子自由基清除率

(1)

式中：A0，無水乙醇替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，無水乙醇替代ABTS溶液的吸光值。

1.3.8 DPPH自由基清除率測定

參考王婕娉等[9]的方法稍加修改，精確稱取2 mg DPPH，以無水乙醇定容至25 mL，放置時間不要超過4 h，得DPPH溶液。將200 mL不同濃度的樣品液和400 μL DPPH溶液混合均勻，置于避光的環(huán)境中反應30 min后，在517 nm處測定吸光值，DPPH自由基清除率計算如公式(2)所示。以與樣品同一質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照，以質量濃度與DPPH自由基清除率之間做回歸方程并且計算IC50。

DPPH自由基清除率

(2)

式中：A0，無水乙醇替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，無水乙醇替代DPPH溶液的吸光值。

1.3.9 ·OH清除率測定

采用水楊酸-硫酸亞鐵法，參照許繼業(yè)等[10]的方法稍加修改，反應體系中依次加入9 mmol/L 水楊酸-乙醇、9 mmol/L FeSO4、不同濃度的樣品溶液及8.8 mmol/L H2O2各1 mL，各組分37 ℃恒溫水浴反應15 min后，在510 nm處測定反應液的吸光度值，·OH 清除率計算如公式(3)所示。以與樣品同一質量濃度的L-抗壞血酸做陽性對照，以質量濃度與·OH 清除率之間做回歸方程并且計算IC50。

·OH清除率

(3)

式中：A0，去離子水替代樣品的吸光值；A1，添加樣品的吸光值；A2，去離子水替代H2O2溶液的吸光值。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個試驗重復3次，結果取平均值。利用Minitab 18.0、Design expert 10.0、GraphPad prime 9.0進行試驗設計及數(shù)據(jù)分析，P<0.05 表示達到顯著性差異水平。圖表采用OriginPro 2019b繪制。

2 結果與分析

2.1 混菌兩段發(fā)酵主效應因子篩選

以發(fā)酵液中茶籽多肽產(chǎn)量為指標，對影響兩段發(fā)酵過程的諸多因素進行篩選，Plackett-Burman試驗設計及結果如表1所示，各因子對茶籽多肽產(chǎn)量的顯著性分析如表2所示。從表2可以看出，備選的10個因素均對茶籽多肽的產(chǎn)量呈現(xiàn)正效應影響，其中主料茶籽粉、初始發(fā)酵pH及Ⅰ段發(fā)酵溫度達到顯著水平(P<0.05)，是影響茶籽多肽產(chǎn)量的主效應因子。因此，選定此3個因素作為下一步響應面試驗的優(yōu)化因素。

表1 PB試驗設計及結果
Table 1 Plackett-Burman experimental design and results

2.2 最陡爬坡試驗

由表2可知，茶籽粉、初始發(fā)酵pH及Ⅰ段發(fā)酵溫度3個因素均呈顯著正效應，需要進行爬坡試驗以確定各因素的最陡上升路徑和最高取值水平。爬坡試驗以各因素的PB試驗中心點開始，沿3個因素取值增加的方向移動。從表3可以看出，當茶籽粉70 g/L、初始發(fā)酵pH 9.0、Ⅰ段發(fā)酵溫度40 ℃時，多肽產(chǎn)量有明顯躍升，達到7.72 mg/mL，此后開始回落，因此選擇T2組對應的各因素的水平值為后續(xù)優(yōu)化試驗的中心點，設計響應面優(yōu)化試驗。

表2 PB試驗設計因子水平及影響因子的顯著性分析
Table 2 Factors levels and significance analysis of Plackett-Burman

注：*表示差異顯著(P<0.05)

表3 最陡爬坡試驗結果
Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

2.3 響應面優(yōu)化茶籽多肽發(fā)酵條件

基于PB試驗及最陡爬坡試驗結果分析，選定茶籽粉(X1)、初始發(fā)酵pH(X2)、Ⅰ段發(fā)酵溫度(X3)，設計三因素三水平Box-Behnken試驗，進行多因素試驗優(yōu)化，因素及水平見表4。通過對表5數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到茶籽粉、初始發(fā)酵pH、Ⅰ段發(fā)酵溫度與茶籽多肽產(chǎn)量(Y)關系的回歸模型：Y=8.73+0.93X1+0.81X2+0.11X3-0.025X1X2-X1X3-0.042X2X3-0.90X12-1.99X22-1.33X32。

表4 Box-Behnken設計因子及水平
Table 4 Factors and levels of Box-Behmken design

表6為回歸模型方差分析。從表6可知，該模型P=0.005 6，失擬項P=0.600 9，相關系數(shù)R2=0.963 7，說明該回歸模型極顯著，失擬項不顯著，擬合程度良好，誤差小，可以用此模型對茶籽多肽的發(fā)酵進行預測。模型中X1、X2、X12、X22、X32對Y值的影響均達到或超過顯著水平，說明三因素對多肽產(chǎn)量的影響不是單純的線性關系，其各自的二次項也存在顯著影響；其影響效果為茶籽粉>初始發(fā)酵pH>Ⅰ段發(fā)酵溫度，其中茶籽粉、初始發(fā)酵pH均達到極顯著水平。

表5 Box-Behnken設計及結果
Table 5 Result and design of Box-Benhmken

表6 Box-Behnken設計方差分析
Table 6 Analysis of variance(ANOVA) analysis of Box-Behnken

注：**表示差異極顯著(P<0.01)

對以上三因素作響應面圖，從圖1可以看出，在所選變量區(qū)域內(nèi)，茶籽多肽產(chǎn)量存在極大值。回歸方程求解后，得到三因素的最優(yōu)值為：茶籽粉75.23 g/L、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵溫度39.87 ℃(取值40 ℃)，結合前期單因素試驗及PB試驗各因素的取值水平，確定優(yōu)化的發(fā)酵條件為：茶籽粉75.23 g/L、葡萄糖4.0 g/L、UIM-281接種量1%、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵時間24 h、PI142接種量0.5%、Ⅱ段發(fā)酵時間24 h、兩段發(fā)酵溫度恒定40 ℃，搖床轉速120 r/min。在該條件下，進行3次重復驗證實驗，得到茶籽多肽的實際產(chǎn)量為8.97 mg/mL，接近理論最大理論預測值9.06 mg/mL，表明該模型可以較好地指導茶籽多肽的混菌發(fā)酵生產(chǎn)。

a-初始發(fā)酵pH和茶籽粉；b-I段發(fā)酵溫度與茶籽粉；c-I段發(fā)酵溫度與初始發(fā)酵pH
圖1 茶籽粉、初始發(fā)酵pH、I段發(fā)酵溫度間交互影響的響應面圖
Fig.1 Response surface diagram of tea seed concentration, initial pH and the first stage temperature

2.4 茶籽多肽的抗氧化活性

2.4.1 ABTS陽離子自由基清除活性

未發(fā)酵茶籽T0、發(fā)酵后茶籽多肽Ts及維生素C的ABTS陽離子自由基清除效果如圖2所示。T0、Ts對ABTS陽離子自由基清除活性存在正相關量效關系。同一濃度下，Ts的ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于T0，其ABTS陽離子自由基半抑制濃度為0.358 mg/mL，顯著低于T0的IC50值0.807 mg/mL(P<0.05)。以上表明，茶籽原料經(jīng)發(fā)酵水解后產(chǎn)生的小分子質量多肽具有更強的ABTS陽離子自由基清除能力。茶籽蛋白中富含色氨酸[18]，色氨酸是環(huán)狀氨基酸，含有苯環(huán)，能夠為自由基提供質子，減緩自由基的鏈式反應，推測茶籽中的蛋白質組分經(jīng)微生物分解后，暴露出更多的色氨酸殘基，進而賦予其ABTS陽離子自由基高清除活力[19]。

圖2 不同組分對ABTS陽離子自由基清除活性
Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different components

2.4.2 DPPH自由基清除活性

T0、Ts及維生素C對DPPH的清除能力如圖3所示。DPPH清除率隨T0、Ts濃度的增加而逐漸提高，不同濃度下Ts的DPPH清除率均>50%，質量濃度1 mg/mL時的最高清除率達到85.5%，顯著高于T0。以質量濃度對DPPH自由基清除率做回歸方程，得到T0、Ts、維生素C的IC50值分別為0.796、0.164、0.01 mg/mL，表明低分子質量茶籽多肽Ts較未發(fā)酵茶籽原料具有更強的DPPH清除能力。王南南等[14]以酶解法制備茶渣蛋白肽，獲得的低分子質量肽段(<5 kDa)具有最強的DPPH自由基清除活性，與本實驗結果一致。

圖3 不同組分對DPPH自由基清除活性
Fig.3 DPPH radical scavenging activity of different components

2.4.3 ·OH清除活性

由圖4可知，相對于ABTS陽離子自由基、DPPH自由基清除活性而言，T0、Ts的·OH清除能力較弱，且整體顯著低于維生素C。Ts的·OH清除率隨其濃度的增加而逐漸提高，IC50值為3.537 mg/mL，顯著高于同濃度下T0的·OH清除活性。推測是茶籽經(jīng)UIM-281、PI142混菌發(fā)酵后，原料蛋白被水解成小分子多肽，其氨基酸組成中富含的苯丙氨酸、酪氨酸等疏水性殘基，提高了其·OH清除活性[20]。

圖4 不同組分對·OH清除活性
Fig.4 The scavenging activity of different components on hydroxyl radical

3 結論

以茶籽為原料，采用靈芝菌和解淀粉芽孢桿菌混菌順序兩段發(fā)酵工藝制備茶籽多肽，并對茶籽多肽產(chǎn)物的抗氧化活性進行研究。通過Plackett-Burman設計、最陡爬坡設計以及響應面分析試驗，獲得了茶籽多肽制備的回歸模型和優(yōu)化參數(shù)為：茶籽粉75.23 g/L、葡萄糖4.0 g/L、UIM-281接種量1%、初始發(fā)酵pH 9.20、Ⅰ段發(fā)酵時間24 h、PI 142接種量0.5%、Ⅱ段發(fā)酵時間24 h、兩段發(fā)酵溫度恒定40 ℃，搖床轉速120 r/min，茶籽多肽產(chǎn)量達到8.97 mg/mL。以超濾法獲得低分子質量肽段Ts的體外抗氧化能力顯著優(yōu)于未發(fā)酵茶籽原料，其ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH清除半抑制濃度分別為0.358、0.164、3.537 mg/mL，可為茶籽資源的高值化應用及茶籽多肽產(chǎn)品開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)支持。