傳統(tǒng)工藝下發(fā)酵時間對大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

大河烏豬是云南省首次育成的生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉和優(yōu)質(zhì)干腌火腿的兼用型豬種，以肉質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特著稱[1]。風(fēng)味是火腿最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一[2]，發(fā)酵是火腿風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段[3]，已有大量關(guān)于火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究。鄭璞等[4]發(fā)現(xiàn)盤縣火腿在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類增加了15種，其中醛類物質(zhì)的種類和含量最豐富；王嬡嫡[5]發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，宣威火腿的特征性風(fēng)味物質(zhì)含量增加，風(fēng)味趨好；譚椰子等[6]對不同年份金華火腿、浦記火腿和如皋火腿進(jìn)行分析鑒定，共檢出62種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其中15種(醛類10 種)化合物具有較高的氣味活度值，對火腿風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)；GIOVANELLI等[7]比較了帕爾馬、圣丹尼和托斯卡諾火腿發(fā)酵過程中理化、形態(tài)和芳香特征的演變，發(fā)現(xiàn)隨著加工時間延長，火腿風(fēng)味物質(zhì)更豐富，香氣明顯改善。然而，目前有關(guān)大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究較少。

傳統(tǒng)干腌火腿屬于自然發(fā)酵肉制品，通常是按季節(jié)、氣候控制生產(chǎn)時間，傳統(tǒng)工藝條件即在自然條件下對火腿進(jìn)行冷涼后熟、修割整形、上鹽腌制等加工，經(jīng)過脫水平衡，最后發(fā)酵產(chǎn)香得到成熟火腿。本研究以傳統(tǒng)工藝條件下生產(chǎn)的大河烏豬火腿為研究對象，研究發(fā)酵時間(90、150、210、270、450、630 d)對火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，以期為大河烏豬火腿的風(fēng)味品質(zhì)及形成機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大河烏豬火腿(10±1)kg，云南東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置及SPME萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；JJ-2BS組織搗碎機(jī)，常州崢嶸儀器有限公司；超低溫冰箱，上海艾本德國際貿(mào)易有限公司；透明頂空萃取瓶(20 mL)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大河烏豬火腿的生產(chǎn)工藝

大河烏豬火腿的生產(chǎn)工藝如下：

172只新鮮后腿→冷涼后成熟18 h→修割整形→上鹽腌制21 d→脫水平衡60 d→發(fā)酵產(chǎn)香90～630 d→成熟火腿

1.3.2 火腿采樣

從發(fā)酵時間為90、150、210、270、450、630 d的6個組中分別隨機(jī)抽取4只火腿，共計24只火腿，將半膜肌和股二頭肌按1∶1的質(zhì)量比混合，組織搗碎機(jī)攪碎后真空包裝并保存在-20 ℃?zhèn)溆?，每個發(fā)酵周期結(jié)束后立即對樣品進(jìn)行測定。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取及GC-MS條件

頂空固相微萃取條件：參照HUAN等[8]的方法，稱取肉樣5.00 g于20 mL頂空瓶中；將老化后的50/30 μm萃取頭插入頂空瓶上部，于50 ℃吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC進(jìn)樣口，于210 ℃解析5 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

GC-MS參數(shù)參考郇延軍等[9]和等[2]的方法并稍作修改。GC條件:色譜柱：DB-5 MS毛細(xì)色譜柱(30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min 升至250 ℃并保持7 min；載氣He(純度≥99.999%)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比1∶30。

MS條件:傳輸線溫度280 ℃，離子源EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～450。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定

參照王勇勤等[10]和高韶婷等[11]的方法對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

揮發(fā)性物質(zhì)的定性：將測得各揮發(fā)物的譜圖與NIST 2008和Wiley 9 譜庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖進(jìn)行比對，僅報道正反匹配度均大于800(最大值為1 000)的結(jié)果；同時計算各揮發(fā)物的保留指數(shù)(retention index，RI)并與文獻(xiàn)中的RI進(jìn)行比對，RI的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Rt(x)、Rt(n)及Rt(n+1)分別為待測揮發(fā)性成分、含n個碳原子正構(gòu)烷烴及n+1個碳原子正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

揮發(fā)性物質(zhì)的定量：采用峰面積歸一化法。

1.3.5 關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)評定方法[12]

采用相對香氣活度值法(relative odor activity value，ROAV)，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：ROAVi為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對氣味活度值；Ci為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量；Tstan為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值；Cstan為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量；Ti為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010以峰面積歸一化法，計算各揮發(fā)性化合物的相對含量，結(jié)果輸出形式以x±s計。SIMCA14.1進(jìn)行偏最小二乘-判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大河烏豬火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的變化

大河烏豬火腿在發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化見表1和表2，發(fā)酵過程中共鑒定到135種揮發(fā)性化合物，6個發(fā)酵期(90、150、210、270、450和630 d)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為51、37、53、57、58、73種，包括醛、醇、烴、酸、酮、酯及其他類化合物，它們的變化初步反映了火腿風(fēng)味的形成過程。

大河烏豬火腿6個發(fā)酵期共檢測到18種醛類物質(zhì)，且相對含量呈先增加后降低的變化趨勢，醛類是大河烏豬火腿每個發(fā)酵階段相對含量最多的一種成分。研究發(fā)現(xiàn)，醛類化合物主要是脂質(zhì)降解以及亮氨酸與異亮氨酸Strecker降解生成的，醛類物質(zhì)含量高且風(fēng)味閾值較低，在火腿風(fēng)味中起著至關(guān)重要的作用[13]；SABIO等[14]發(fā)現(xiàn)，Bayonne、Corsican、Iberian、Parma和Serrna火腿中的醛類物質(zhì)在揮發(fā)性風(fēng)味成分中占比達(dá)50%以上；要萍等[15]發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)是宣威火腿中最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，與本研究結(jié)果類似。

醇類化合物閾值較高，因而對風(fēng)味的貢獻(xiàn)度不高[16]。在大河烏豬火腿的整個發(fā)酵過程中，醇類物質(zhì)相對含量在11.25%～16.60%變化，發(fā)酵至210 d時相對含量最豐富。其中，1-辛烯-3-醇是大河烏豬火腿每個發(fā)酵期相對含量最豐富的醇類，1-辛烯-3-醇又稱蘑菇醇，具有蘑菇香味，通常是肉制品最豐富的醇類，在Iberico干腌火腿中較為常見[17]。

大河烏豬火腿不同發(fā)酵期共鑒定得到33種烴類物質(zhì)，發(fā)酵至630 d時種類最豐富，共檢測出20種。高韶婷等[11]在金華火腿中共檢測到6種烴類物質(zhì)，與其相比，大河烏豬火腿中的烴類物質(zhì)較多，但由于烴類物質(zhì)的閾值較大，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)率幾乎可以忽略不計。

酯類物質(zhì)代表成熟肉制品的風(fēng)味，閾值較低，對火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[18]。大河烏豬火腿中共檢測出14種酯類物質(zhì)，發(fā)酵至90 d時相對含量(11.32%)最豐富，發(fā)酵至450 d時檢測出1種內(nèi)酯類物質(zhì)(γ-丁內(nèi)酯)，內(nèi)酯類物質(zhì)對火腿的風(fēng)味具有重要的作用，趙冰等[19]檢測出γ-己內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯為特級金華火腿中的特征風(fēng)味物質(zhì)。

酮類化合物一般具有奶香或果香味，是火腿香氣的重要組成部分[20]。大河烏豬火腿6個發(fā)酵階段酮類物質(zhì)相對含量和種類不斷變化，共檢測到15種酮類物質(zhì)。酮類物質(zhì)作為一種羰基化合物，它的相對含量比醛類少，閾值也比同分異構(gòu)體的醛類物質(zhì)高[21]，因此對干腌火腿風(fēng)味的貢獻(xiàn)小于醛類，但有增強(qiáng)風(fēng)味的作用。

酸類化合物可能來自于火腿中磷脂和總?cè)ヵ８视偷慕到?，其閾值較高，對食品風(fēng)味沒有直接的影響[25]，大河烏豬火腿發(fā)酵成熟過程中共檢測到10種酸類物質(zhì)，相對含量在0.36%～6.14%，發(fā)酵150 d時相對含量最豐富。要萍等[15]在宣威火腿中只有檢測到1種酸類物質(zhì)；鄭璞等[4]發(fā)現(xiàn)，盤縣火腿在成熟過程中共檢測到7種酸類物質(zhì)，酸類物質(zhì)含量呈上升趨勢，與本研究結(jié)果不同，可能是由于工藝和豬肉品種引起的差異。

大河烏豬火腿中其他類共檢測出22種，包括芳香族類和一些雜環(huán)化合物，芳香族類物質(zhì)同烷烴類一樣具有較高的閾值，對火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[13]，雜環(huán)化合物是美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物，可賦予肉制品強(qiáng)烈的肉香味，是干腌火腿中重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[22]。

表1 發(fā)酵過程中火腿揮發(fā)性風(fēng)味成分
Table 1 Volatile flavor components during fermentation of ham

續(xù)表1

續(xù)表1

注：-表示未檢出該物質(zhì)；相對含量計算方法(峰面積歸一化法)：每只火腿所測得所有成分的峰面積相加得到總面積，用單個成分的峰面積除以總面積，即得到各成分的相對含量(下同)

表2 火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及相對含量
Table 2 Composition and relative contents of volatile flavor compounds during the fermentation of ham

2.2 PLS-DA發(fā)酵時間對大河烏豬火腿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

PLS-DA結(jié)果如圖1所示，累計 R2X=0.813，R2Y=0.927，Q2=0.766，Hotelling圖顯示(圖2)所有樣品均處于95%Hotelling T2置信區(qū)間內(nèi)，沒有發(fā)現(xiàn)“離群樣本點(diǎn)”，說明該模型有較好的預(yù)測能力。從樣本的聚集、離散程度看來，發(fā)酵90、150 d的樣本分別聚集在不同的象限，而發(fā)酵至210、270、450、630 d的樣本聚集在一起，說明這4個時期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成相似，主體風(fēng)味成分在發(fā)酵至210 d就已基本形成，該結(jié)果與SHI等[23]研究的腌制24 d發(fā)酵90～630 d的大河烏豬火腿類似。

圖1 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分PLS-DA得分圖
Fig.1 PLS-DA score plot of volatile flavor components during fermentation

圖2 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分Hotelling T2 分布圖
Fig.2 Hotelling T2 value range plot of volatile flavor component during fermentation

2.3 ROAV分析發(fā)酵時間對大河烏豬火腿關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的影響

如表3所示，大河烏豬火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物(ROAV≥1)有17種：己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、(Z)-6-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、苯乙醛、(E)-2-癸烯醛、2，3-辛二酮、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、庚醇、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚、2-戊基呋喃，與金華火腿和伊比利亞火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物類似[24-25]。在發(fā)酵的6個時期火腿的關(guān)鍵風(fēng)味化合物(ROAV≥1)種類分別為11、8、9、10、12、15種，除了未查到閾值的化合物，在大河烏豬火腿成熟的6個發(fā)酵時期中，ROAV最大的均為醛類，已有研究證明，醛具有較低的氣味閾值，對干腌火腿的整體風(fēng)味起著重要作用[12,26]。

由表3可知，發(fā)酵至90 d，火腿中ROAV較大的是壬醛、辛醛和(Z)-6-壬烯醛；發(fā)酵至150 d，火腿中ROAV較大的是3-甲基丁醛、己醛和1-辛烯-3-醇；發(fā)酵210、270、450、630 d，火腿中ROAV較大物質(zhì)均為辛醛、壬醛和1-辛烯-3-醇，表明從發(fā)酵210 d開始對大河烏豬火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的風(fēng)味物質(zhì)相同，與PLS-DA得到的結(jié)果類似，再次說明發(fā)酵至210 d時主體風(fēng)味物質(zhì)已形成。

表3 火腿發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分氣味貢獻(xiàn)表
Table 3 Odor contribution of volatile components during fermentation of ham

注：氣味閾值來自文獻(xiàn)[27-28]；表中僅列出ROAV≥0.1的物質(zhì)

3 結(jié)論

大河烏豬火腿發(fā)酵過程中共鑒定到135種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括醛、醇、酸、烴、酮、酯及其他類化合物。發(fā)酵210、270、450、630 d大河烏豬火腿中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成相似，說明發(fā)酵210 d火腿的主體風(fēng)味物質(zhì)已基本形成，大河烏豬火腿的加工期可定為10～12個月；發(fā)酵過程中火腿的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)有己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、(Z)-6-壬烯醛、(E)-2-壬烯醛、3-甲基丁醛、苯乙醛、(E)-2-癸烯醛、2，3-辛二酮、3-羥基-2-丁酮、1-辛烯-3-醇、庚醇、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚、2-戊基呋喃等17種。研究為大河烏豬火腿特征風(fēng)味物質(zhì)的確定及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理研究奠定一定基礎(chǔ)。