不同茶菌發(fā)酵液對病原細(xì)菌抑制作用的比較分析

紅茶菌(kombucha)，又稱茶菌，是以糖茶水為原料，經(jīng)由酵母、醋酸菌和乳酸菌組成的共生菌群發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵茶飲料[1]。用來發(fā)酵紅茶菌的茶葉一般為紅茶，大量文獻(xiàn)報道也可以利用其他原料來替代紅茶，如不同類型茶葉、水果、草藥和香料等，開發(fā)出新型風(fēng)味和功能的產(chǎn)品[2-3]。銀杏是一種廣泛分布在我國的藥食同源植物，其葉片中化學(xué)物質(zhì)種類繁多、含量豐富，活性成分如黃酮類化合物(16.6 mg/g)多達(dá)20幾種，萜類和總多酚含量分別占比0.42%和6.89%，必需氨基酸含量約占總氨基酸含量的40%，維生素、微量元素和酚酸類含量占比也很高[4]。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉的主要提取物，如多糖類、黃酮類化合物和銀杏酚酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用[5-6]。使用替代原料在發(fā)酵過程中不僅可以為茶菌的生長提供碳、氮源，其成分的生物轉(zhuǎn)化也賦予茶菌不同的理化性質(zhì)和更強的生物活性[2-3]。

紅茶菌發(fā)酵液能有效抑制革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌生長[7]，但對霉菌的抑制作用有限[8]。目前對茶菌發(fā)酵液的抑菌作用研究基本集中在對抗生素敏感性致病菌，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和幽門螺桿菌等的敏感性菌株[9]，而對耐藥菌的抑菌效果研究很少。病原菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)重，究其原因是抗菌藥物的濫用，其中大腸桿菌與鮑曼不動桿菌傳播廣泛，極易對抗生素產(chǎn)生耐藥性，在外界不斷刺激下，亦可產(chǎn)生多重耐藥性[10-11]，如何有效抑制及感染后治療是目前亟待解決的難題。

本研究以紅茶、綠茶和銀杏葉3種材料制備茶菌發(fā)酵液，觀察并檢測發(fā)酵液的理化性質(zhì)；采用瓊脂擴散法和牛津杯法體外檢測3種茶菌發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原細(xì)菌的敏感性菌株和大腸桿菌、鮑曼不動桿菌的多重耐藥菌株的抑制效果；并選取銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株，探究不同發(fā)酵時間對銀杏茶菌發(fā)酵液抑菌效果的影響。通過有益微生物的發(fā)酵作用提高茶葉和銀杏的抑菌生理活性，發(fā)展對病原細(xì)菌(特別是耐藥菌)具有抑制作用的功能微生物發(fā)酵產(chǎn)品。以期在大力倡導(dǎo)減少抗生素濫用的背景下，為新型食品防腐劑和抑菌藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

紅茶菌菌種、大腸桿菌(Escherichia coli)01菌株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes),由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供;多重耐藥性菌株大腸桿菌T5(耐氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素和妥布霉素)、大腸桿菌P1-D6(耐氨芐青霉素、氯霉素和慶大霉素)和鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii ，耐慶大霉素、妥布霉素、瀏陽霉素、卡那霉素和氨芐青霉素)，由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院付新苗教授惠贈。所有菌株使用前暫存于-4 ℃冰箱。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉5.0，121 ℃滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉10.0，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基購自成都彼樣生物科技有限公司。紅茶糖水培養(yǎng)液：紅茶5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。綠茶糖水培養(yǎng)液：綠茶5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。銀杏茶糖水培養(yǎng)液(g/L)：銀杏5 g，白砂糖40 g，蒸餾水800 mL。

1.2 茶葉及試劑

紅茶、綠茶、銀杏葉，福建省福州市市場；氫氧化鈉、酵母浸膏、瓊脂等，國藥化學(xué)試劑公司；細(xì)菌學(xué)蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物公司。

1.3 供試菌培養(yǎng)

挑取1環(huán)供試菌(芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5、01、P1-D6、痤瘡丙酸桿菌)在LB固體平板上劃線，劃線后平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后挑選大小適中的單菌落通過劃線進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。從純化的平板上挑取菌體接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于搖床37 ℃，220 r/min培養(yǎng)24 h后，獲得菌懸液。

肺炎鏈球菌活化，挑取1環(huán)肺炎鏈球菌在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線，劃線平板置于37 ℃，5%～10% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后挑選單菌落通過劃線進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。用移液槍吸取1 mL無菌水于純化的平板上，并用接種環(huán)刮取菌體混于無菌水中，制備菌懸液。

1.4 茶菌發(fā)酵及樣品制備

參照汪鵬輝等[12]的方法培養(yǎng)茶菌和制備發(fā)酵液樣品。發(fā)酵液分別以紅茶、綠茶、銀杏為原料。首先用沸水將所用器具紗布等清潔殺菌，在800 mL沸水中分別加入5 g紅茶、綠茶和銀杏葉，待浸泡10 min后用4層滅菌紗布過濾，在濾液中加入40 g白砂糖，充分?jǐn)嚢璧玫教遣杷?。待糖茶水冷卻至室溫后，用ddH2O補充至800 mL。在無菌環(huán)境中加入200 mL發(fā)酵7～10 d的茶菌母液，混勻，并以4層滅菌紗布封口，在28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d，得到茶菌發(fā)酵液。

茶菌發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾去除發(fā)酵液中較大顆粒雜質(zhì)后，8 000 r/min離心5 min，取上清液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾。收集濾液至100 mL，經(jīng)凍干處理48 h后得到發(fā)酵液干粉，用1 mL無菌水稀釋，存放于-20 ℃待用。

1.5 茶菌發(fā)酵過程觀察和理化指標(biāo)測定

茶菌發(fā)酵后，每天觀察發(fā)酵液的變化，至發(fā)酵后7 d記錄發(fā)酵液中菌膜、發(fā)酵液渾濁度、風(fēng)味的數(shù)據(jù)；測定發(fā)酵液OD值、pH值、酸度和還原糖含量[12]。

1.6 抑菌試驗

采用牛津杯-瓊脂擴散法檢測不同茶菌樣品的抑菌能力[13]。LB培養(yǎng)基于超凈工作臺中混勻倒平板并冷卻至室溫后，加入100 μL供試菌懸浮液，涂布均勻。將滅菌后的牛津杯用無菌鑷子固定在涂布有供試菌懸液的培養(yǎng)基平板上，每個平板中放置3個牛津杯。待牛津杯固定后，向杯中加入200 μL以上凍干后稀釋的發(fā)酵液，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。觀察有無抑菌作用，測量并記錄抑菌圈的大小。

將100 μL肺炎鏈球菌懸浮液涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，用直徑為9 mm的無菌打孔器在哥倫比亞血瓊脂平板上打孔，每孔加入200 μL發(fā)酵液樣品，置于37 ℃，5%～10% CO2恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h后。觀察抑菌圈的大小并做記錄。

將平板倒置于光線充足處，用游標(biāo)卡尺“十”字法測量抑菌圈大小，并計算相對抑菌圈大小。相對抑菌圈大小計算如公式(1)所示：

相對抑菌圈/mm=D-d

(1)

式中：D，抑菌圈直徑，mm；d，打孔器直徑，mm。

1.7 發(fā)酵時間對茶菌抑菌作用的影響

按以上銀杏培養(yǎng)液的配方和培養(yǎng)方法，分別在發(fā)酵后第5、9、13、17、21天取樣，發(fā)酵液經(jīng)過濾滅菌和凍干處理，編號后放置冰箱凍藏。按以上抑菌試驗方法觀察和測定不同發(fā)酵時間樣品對銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株的抑制效果。

1.8 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗圖像采用圖像分析軟件Adobe Illustrator進(jìn)行處理。實驗數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件Graph Pad Prism 6和Oringin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。所得的結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液理化性質(zhì)比較

經(jīng)多次預(yù)試驗，紅茶菌在銀杏葉粉配制的糖水培養(yǎng)液中生長良好，培養(yǎng)5～14 d，在培養(yǎng)液表面形成明顯的菌膜。因此，進(jìn)一步比較茶菌在不同原料配制的培養(yǎng)液中的表現(xiàn)。發(fā)酵7 d后，觀察和測定紅茶、綠茶、銀杏發(fā)酵液的理化表現(xiàn)和數(shù)據(jù)如表1所示。在綠茶和紅茶配制的茶糖水培養(yǎng)液中，菌體生長明顯，發(fā)酵后第2天即可見培養(yǎng)液中不斷產(chǎn)生細(xì)小氣泡，發(fā)酵后第3天在培養(yǎng)液表面形成明顯的菌膜。在銀杏糖水培養(yǎng)液中，菌體生長較慢，氣泡產(chǎn)生遲，數(shù)量也相對較少；菌膜的形成相比綠茶和紅茶糖水培養(yǎng)液慢，菌膜薄。未溶解的銀杏固形物易被絮狀的膜吸附，使發(fā)酵液變澄清。銀杏糖水經(jīng)發(fā)酵后更加清亮，具有酸甜風(fēng)味和清香。銀杏糖水發(fā)酵液在色、香、味方面要優(yōu)于紅茶與綠茶，但銀杏茶菌的生長較慢，培養(yǎng)周期略長。發(fā)酵7 d后，紅茶、綠茶和銀杏發(fā)酵液的pH值分別為3.08、2.83和2.75。

表1 發(fā)酵7 d后3種茶菌發(fā)酵液理化性質(zhì)比較
Table 1 Comparison of physicochemical properties of three different kombucha tea after 7 days of fermentation

2.2 茶菌發(fā)酵液對病原細(xì)菌的抑制作用

以紅茶為原料的茶菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和痤瘡丙酸桿菌的相對抑菌圈直徑分別為4.5、4.33、16.7 mm(表2，圖1)，對痤瘡丙酸桿菌的抑制效果最為明顯；對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌01菌株、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等菌株沒有抑制效果。以綠茶為原料的茶菌發(fā)酵液對供試的銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等菌株均有抑制作用；其中，對銅綠假單胞桿菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到23.33 mm，與其他菌株相比差異顯著(P<0.05)。和紅茶為原料的發(fā)酵液相比，以綠茶為原料的發(fā)酵液對大腸桿菌多重耐藥菌株T5和P1-D6也有較強的抑制作用，相對抑菌圈直徑達(dá)到18 mm左右(表2)。

表2 茶菌發(fā)酵液對致病菌的抑制作用
Table 2 Inhibitory effects of tea fungus broth on growth of pathogenic bacteria  N=3)

注：相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

A-紅茶菌發(fā)酵液對銅綠假單胞菌的抑制作用；B-紅茶菌發(fā)酵液對
金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-紅茶菌發(fā)酵液對大腸桿菌T5菌株的
抑制作用；D-綠茶菌發(fā)酵液對銅綠假單胞菌的抑制作用；E-綠茶菌
發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用；F-綠茶菌發(fā)酵液對大腸桿菌T5
菌株的抑制作用
圖1 茶菌發(fā)酵液對病原菌的抑菌作用比較
Fig.1 Inhibitory effects of tea fungus broth on growth of pathogenic bacteria

2.3 銀杏茶菌發(fā)酵液對病原細(xì)菌的抑制作用

2.3.1 對敏感菌的抑制效果

銀杏茶菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌01菌株等抗生素敏感菌株的相對抑菌圈大小分別為21.67、12.50、2.03、4.33 mm(圖2)。銀杏茶菌發(fā)酵液對3株肺炎鏈球菌也有一定的抑制效果。對Ⅰ型肺炎鏈球菌、Ⅱ型肺炎鏈球菌和Ⅲ型肺炎鏈球菌的相對抑菌圈大小分別為3.67、9.83、6.50 mm(圖2)。

A-銀杏茶菌發(fā)酵液對不同病原細(xì)菌抑菌圈大小比較；
B-銀杏茶菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-銀杏茶菌
對Ⅱ型肺炎鏈球菌的抑制作用
圖2 銀杏茶菌發(fā)酵液對病原細(xì)菌的抑菌作用
Fig.2 Inhibitory effects of ginkgo kombucha broth on growth of pathogenic bacteria

2.3.2 對多重耐藥菌的抑制效果

銀杏茶菌發(fā)酵液對多重耐藥性菌株鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6的相對抑菌圈大小分別為7.83、13.00、15.33 mm(圖2-A，圖3)。

A-大腸桿菌T5菌株；B-大腸桿菌P1-D6菌株；C-鮑曼不動桿菌
圖3 銀杏茶菌發(fā)酵液對多重耐藥菌的抑菌作用
Fig.3 Inhibitory effects of ginkgo kombucha on growth of multidrug resistant bacteria

2.4 發(fā)酵時間對銀杏茶菌抑菌作用的影響

在17 d的發(fā)酵時間內(nèi)，銀杏茶菌發(fā)酵液的抑菌作用隨時間變化而增強；發(fā)酵后第17天對銅綠假單胞菌和大腸桿菌T5抑制作用最強，抑菌圈大小分別達(dá)到2.91、3.69 cm(表3，圖4)。但是，發(fā)酵后21 d進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在抑菌圈的范圍內(nèi)，逐漸可見有細(xì)菌的生長，抑菌效果逐漸較弱。

表3 發(fā)酵時間對銀杏茶菌抑菌效果的影響 單位：cm

Table 3 Effect of fermentation time on antibacterial effect of ginkgo kombucha 

注：-表示未出現(xiàn)抑菌圈

A-發(fā)酵5 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用；B-發(fā)酵9 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用；C-發(fā)酵17 d銀杏茶菌對銅綠假單胞桿菌的抑制作用;D-發(fā)酵5 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用；E-發(fā)酵9 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用；F-發(fā)酵17 d銀杏茶菌對大腸桿菌T5菌株的抑制作用
圖4 不同發(fā)酵時間對銀杏茶菌抑菌作用的影響
Fig.4 Effects of fermentation time on inhibition activities of ginkgo kombucha

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，3種茶菌發(fā)酵液對不同細(xì)菌的抑菌活性存在顯著差異。綠茶菌發(fā)酵液對供試病原細(xì)菌的敏感菌株和耐藥菌株均有明顯的抑制作用，其中對銅綠假單胞菌的抑制活性最強，對大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱；銀杏茶菌發(fā)酵液對敏感菌株和耐藥菌株均有抑制作用，對金黃葡萄球菌的抑制活性最強，對大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱。而紅茶菌發(fā)酵液只對痤瘡丙酸桿菌、金黃葡萄球菌和銅綠假單胞菌有一定的抑制作用，對芽孢桿菌和鮑曼不動桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等3個耐藥菌株均無抑菌活性?？傮w上，3種茶菌發(fā)酵液的抑菌活性強弱依次為：綠茶菌>銀杏茶菌>紅茶菌。

除了痤瘡丙酸桿菌，綠茶菌發(fā)酵液對其他供試菌的抑制作用明顯優(yōu)于紅茶菌發(fā)酵液。已有的研究結(jié)果表明，不同茶葉或不同植物經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，其發(fā)酵液的抑菌效果存在差異[14-16]。如BATTIKH等[14]評估了紅茶、綠茶發(fā)酵21 d后的抗細(xì)菌和抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)對所測試的病原微生物(Candida krusei除外)具有抗菌潛力，而綠茶菌的抑菌潛力最強。與紅茶發(fā)酵后的發(fā)酵液相比，綠茶發(fā)酵液具有更寬的抑菌譜和更強的抑菌活性。紅茶和綠茶發(fā)酵后的抑菌能力存在差異，可能和以下因素有關(guān)：一是不同茶葉和植物葉片所含有的成分存在差異，如綠茶在兒茶素、黃酮類、酚酸類等化合物的種類和含量上與紅茶不同，因而其發(fā)酵后的產(chǎn)物存在差異[16-17]；經(jīng)茶菌發(fā)酵后，發(fā)酵原料的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能呈現(xiàn)不同的抑菌作用[16]。二是不同植物原料發(fā)酵后，發(fā)酵液中有機酸的種類和含量不同。實驗結(jié)果表明綠茶菌發(fā)酵后的酸度顯著高于紅茶菌；pH值的降低及大量有機酸的產(chǎn)生，尤其乙酸的產(chǎn)生也是茶菌具有抑菌效果的重要機制之一[8-9,18]。綠茶菌相比紅茶菌抗菌作用更強，未來可以深入研究其抑菌作用原理，并期望應(yīng)用于醫(yī)療或食品領(lǐng)域。

紅茶菌在銀杏糖水中生長良好，發(fā)酵過程中pH值、酸度和還原糖變化與紅茶菌和綠茶菌相似，而菌膜形成表明使用銀杏發(fā)酵是可行的。銀杏葉中含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，藥用有效成分多達(dá)170余種[19]。銀杏葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑制作用[5-6,13,20]，其中含有的多糖類化合物、黃酮類化合物及銀杏酚酸是抑菌的主要成分[4,20-21]。銀杏茶菌發(fā)酵液對供試的普通病原菌均有不同的抑制效果，而對肺炎鏈球菌和多重耐藥菌株的抑制作用，則進(jìn)一步拓展了銀杏發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌譜。隨著發(fā)酵時間延長，銀杏茶菌發(fā)酵液對銅綠假單胞菌和多重耐藥性大腸桿菌T5菌株的抑菌效果均顯著提高，在第17天達(dá)到最高，之后略有降低。推測在一定的發(fā)酵時間內(nèi)，隨著微生物發(fā)酵過程的不斷進(jìn)行，發(fā)酵液中有機酸、抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生和pH值的下降，促進(jìn)發(fā)酵液的抑菌效果顯著提升。VALIYAN等[22]使用紅茶、綠茶、檸檬葉和薄荷葉為原料進(jìn)行茶菌發(fā)酵，在第21天時顯示出最強的抑菌活性。VOHRA等[23]比較紅茶菌和綠茶菌發(fā)酵7、14、28、60 d的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)第7天兩者均無抑菌效果，而第60天的抑菌效果最好，抑菌效果隨發(fā)酵時間增加而增強。添加銀杏提取物，利用豆醬發(fā)酵劑可以增強發(fā)酵產(chǎn)品的抑菌功能[24]。利用銀杏葉作為紅茶菌的替代原料發(fā)酵進(jìn)行抑菌作用研究尚屬首次，銀杏葉經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后如何改變其活性成分種類和含量，是否增強抑菌活性，需要做進(jìn)一步的研究。

過度使用抗生素導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性，伴隨著環(huán)境的篩選作用，可同時耐受多種抗生素的多重耐藥菌也不斷出現(xiàn)，病原菌的耐藥性已成為日益緊迫的全球健康問題[9]。茶葉主要成分及其制品在抑制耐藥菌株方面已經(jīng)呈現(xiàn)一定的潛力[25]。以茶葉和銀杏為原料的茶菌發(fā)酵液作為一種天然發(fā)酵飲品，其對病原細(xì)菌(尤其是多重耐藥菌株)抑制作用的研究，將有助于食品、飼料防腐劑、抗生素替代品和功能飲料的創(chuàng)新和發(fā)展。