不同培曲工藝對(duì)特香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

我國(guó)白酒釀造工藝歷史悠久，并隨培曲技術(shù)的發(fā)明與改進(jìn)，推動(dòng)了白酒生產(chǎn)的規(guī)?；⒁?guī)范化發(fā)展。不同白酒大曲的原料及其配比不同，但多以小麥、大麥、豌豆等為原料壓制成曲坯，入曲房自然發(fā)酵而成。大曲含有多種微生物和各種酶系，構(gòu)成釀酒的內(nèi)在動(dòng)力；同時(shí)大曲自身所含的微生物代謝產(chǎn)物及原料分解產(chǎn)物，直接或間接構(gòu)成白酒的風(fēng)味物質(zhì)，使白酒具有各種不同的獨(dú)特風(fēng)味[1-3]，故有“曲為酒之骨”之美譽(yù)。

堆曲培養(yǎng)(培曲工藝)是決定大曲質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，堆曲方式與培曲條件的改變均對(duì)大曲質(zhì)量造成不同程度的影響。李偉安等[4]采用傳統(tǒng)與架式2種大曲培養(yǎng)方式，比較兩者大曲理化指標(biāo)與微生物群落結(jié)構(gòu)差異，表明架式大曲更有利于細(xì)菌、乳酸菌和霉菌的生長(zhǎng)。陳可丹等[5]分析不同頂溫的特香型大曲理化指標(biāo)及微生物群落演替差異，表明中頂溫曲的酸性蛋白酶、糖化力、酯化力均高于高頂溫曲。邢鋼等[6]跟蹤測(cè)定了3種不同溫度大曲制作過程中理化指標(biāo)變化，結(jié)果顯示大曲糖化力、酯化力、液化力、發(fā)酵力4項(xiàng)指標(biāo)相差較大，其中中溫大曲最優(yōu)，低溫大曲居中，高溫大曲最小。明紅梅等[7]通過提高制曲品溫來(lái)探究制曲溫度對(duì)醬香型大曲質(zhì)量的影響，結(jié)果表明超高溫大曲的感官質(zhì)量?jī)?yōu)于普通高溫大曲，但糖化力與酯化力明顯較普通高溫大曲更低。

特香型白酒具有“整粒大米為原料、大曲面麩加酒糟、紅褚條石壘酒窖”的工藝特征，以及“濃頭醬尾清中間、三香俱備猶不靠”的風(fēng)味特點(diǎn)[8]。目前對(duì)特香型大曲的研究多集中在大曲理化指標(biāo)及采用可培養(yǎng)手段對(duì)大曲進(jìn)行微生物群落分析[9]，大曲制作過程中培曲方法對(duì)其微生物群落結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道較少見。本研究以特香型大曲為研究對(duì)象，研究不同培曲方法對(duì)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期解決前期發(fā)酵上霉過快、中后期品溫下降迅速的問題，為進(jìn)一步提高特香型大曲質(zhì)量提供理論與技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 大曲樣品采集

在江西四特酒有限責(zé)任公司大曲車間，取4間曲房，其中2間為常規(guī)培曲工藝(traditional culture techniques of Daqu，TT)，2間為新培曲工藝(new culture Techniques of Daqu，NT)，4間曲房分別于0(曲坯入房)、5、10、15、20、25 d(曲坯出房)5點(diǎn)取樣，粉碎后混勻、過篩，置-80 ℃冰箱貯存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

碘、干酪素、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、乳酸鈉、檸檬酸、乳酸、三氯乙酸、羧甲基纖維素鈉、L-酪氨酸、3,5-二硝基水楊、己酸，均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；α-淀粉酶試劑盒，南京建成生物科技有限公司；Omega提取試劑盒 Mag-Bind Soil DNA Kit。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FA2004B電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-3G雷磁電子pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TCL20M高速冷凍離心機(jī)，常州百密思儀器有限公司；HH-3數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；ZFD-5040電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；T1可見光分光光度計(jì)，上海屹譜儀器有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀、SH220 N石墨消解儀，海能儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培曲工藝

大曲原料配方、曲坯制作方法參考文獻(xiàn)[10]。

TT與NT的工藝區(qū)別在于：推遲曲坯覆蓋稻草及翻曲時(shí)間，詳見表1。

表1 特香型大曲不同培曲工藝蓋稻草與翻曲時(shí)間 單位：d

Table 1 Straw-covering times and manual Daqu-turning in different Texiang Daqu culturing techniques

1.2.2 大曲理化指標(biāo)及酶活力測(cè)定

大曲溫度：每天上午和下午各1次，將溫度計(jì)插入大曲約2 cm深度，隨機(jī)測(cè)定3個(gè)曲坯溫度。分別計(jì)算測(cè)定溫度平均值即為大曲溫度。

水分、酸度、酸性蛋白酶活力、纖維素酶活力、糖化力、液化力、酯化力的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.3 大曲微生物量碳、氮測(cè)定

大曲中微生物量碳、氮含量的測(cè)定采用熏蒸浸提法[12-13]。取新鮮的大曲研磨后，置于真空干燥器內(nèi)用去乙醇氯仿黑暗熏蒸24 h，用0.5 mol/L硫酸鉀溶液浸提，取浸提液，抽濾(濾膜< 0.5 μm)，獲得濾液，取濾液分別用重鉻酸鉀氧化法與凱氏法測(cè)定碳、氮含量；另將不熏蒸大曲浸提、抽濾，測(cè)定濾液碳、氮含量，作為對(duì)照。

大曲微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)與大曲微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)測(cè)定如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：EC、EN分別為熏蒸與未熏蒸大曲浸提液有機(jī)碳、氮的差值；0.38、0.45為校正系數(shù)；詳細(xì)測(cè)定、計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[14-16]。

1.2.4 大曲總DNA提取及高通量測(cè)序

樣品的前處理方法參考文獻(xiàn)[17]。采用Omega的提取試劑盒 Mag-Bind Soil DNA Kit提取宏基因組DNA。用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S rRNA的V3～V4區(qū)。用正向引物ITS5F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、反向引物ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增真菌核糖體ITS1。細(xì)菌、真菌擴(kuò)增產(chǎn)物的Illumina MiSeq測(cè)序由派森諾科技有限公司(中國(guó)上海)完成。本文細(xì)菌、真菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)已提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/sra)，登錄號(hào)為PRJNA716114、PRJNA716120。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

本文所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft Office Excel 2016與R語(yǔ)言進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和分析；單因素ANOVA 分析理化指標(biāo)間顯著性，Adonis法分析微生物群落組間顯著性，P< 0.05表示在0.05水平上具有顯著性差異；GraphPad Prism繪制折線圖、R語(yǔ)言繪制豐度圖、Canoco5繪制冗余分析(redundancy analysis，RDA)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲發(fā)酵的理化指標(biāo)及酶活性變化

TT和NT培曲過程中溫度變化如圖1所示，TT與NT工藝大曲品溫均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。TT

圖1 不同培菌工藝的曲房與大曲溫度變化
Fig.1 Deviation of Daqu core temperature from room temperature with different culture techniques
注：當(dāng)日日均溫度數(shù)據(jù)源于天氣網(wǎng)

大曲在發(fā)酵4～9 d時(shí)，品溫較NT的上升快，高出2～6 ℃；在第3次翻曲(10 d)后，從12 d開始TT品溫較NT下降迅速，從12 d至發(fā)酵結(jié)束時(shí)較NT的品溫降低3～12 ℃。表明NT工藝可使曲坯發(fā)酵前期減緩升溫速度、后期放緩降溫速度。

大曲理化指標(biāo)及酶活力變化規(guī)律如圖2所示。NT工藝大曲的纖維素酶活力、糖化力、液化力、酸性蛋白酶活力均顯著高于TT(P<0.05)，酸度低于TT，而兩者的含水量與酯化力差異不顯著。纖維素酶活力和糖化力從發(fā)酵5 d開始NT高于TT，而液化力和酸性蛋白酶活力從發(fā)酵開始后NT一直高于TT，至25 d結(jié)束分別高出63.46%、78.7%。綜上結(jié)果表明NT工藝曲的酶活力優(yōu)于TT。

a-含水量；b-酸度；c-纖維素酶活力；d-糖化力；e-液化力；f-酸性蛋白酶活力；g-酯化力
圖2 不同培曲工藝大曲的理化指標(biāo)及酶活力變化
Fig.2 Effects of different culture techniques on Daqu physicochemical indices and enzymatic activities

2.2 大曲發(fā)酵的MBC、MBN變化

大曲發(fā)酵過程中MBC、MBN動(dòng)態(tài)變化如圖3所示。TT與NT的MBC、MBN差異明顯，但均在15 d時(shí)達(dá)到峰值。NT的MBC在10 d前低于TT，15 d后高于TT，表明在0～10 d期間，TT曲坯微生物生物量大于NT，并在15 d時(shí)達(dá)到最大值，15 d以后后者生物量大于前者。MBN是微生物對(duì)氮素礦化和固持作用的綜合反映[18]，由于MBN大小受微生物生物量、環(huán)境氮素等多重因素影響，NT的MBN僅在發(fā)酵結(jié)束時(shí)高于TT，提高了59%。

2.3 不同培曲工藝大曲微生物多樣性分析

為比較不同培曲工藝對(duì)大曲微生物多樣性的影響，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)TT、NT曲坯進(jìn)行α多樣性評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。每個(gè)樣品文庫(kù)的覆蓋率(coverage)高達(dá)99.8%以上，說明此次測(cè)序結(jié)果可靠。比較各樣品的α指數(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌各項(xiàng)α多樣性指數(shù)均表現(xiàn)上升趨勢(shì)，而真菌α多樣性指數(shù)則呈現(xiàn)先下降后升高，TT曲坯細(xì)菌的Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數(shù)高于同期的NT，NT真菌各項(xiàng)指數(shù)高于同期的TT。綜上結(jié)果表明，TT的細(xì)菌豐度、多樣性高于NT，而真菌則相反，NT高于TT。

a-大曲MBC；b-大曲MBN
圖3 不同培曲工藝對(duì)大曲MBC、MBN的影響
Fig.3 Effects of different culture techniques on microbial carbon and nitrogen biomass in Daqu

表2 不同培曲工藝的大曲微生物群落多樣性和豐度
Table 2 Effect of different culture techniques on Daqu microbial abundance and community diversity

注：OTU為分類操作單元(operational taxonomic units)

2.4 不同培曲工藝對(duì)大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

選取TT、NT細(xì)菌、真菌OTU總數(shù)前10的序列，繪制物種(屬水平)相對(duì)豐度柱狀圖，如圖4-a、圖4-b所示。NT和TT大曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬無(wú)顯著性差異。魏斯氏菌屬(Weissella)、乳桿菌屬(Lactobacilus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和片球菌屬(Pediococcus)是整個(gè)發(fā)酵過程優(yōu)勢(shì)菌(圖4-a)。其中，Weissella在第0天占據(jù)主導(dǎo)地位(相對(duì)豐度83.46%)，第20天時(shí)TT降低至23.8%，NT降低至13.34%；Lactobacilus在0 d時(shí)相對(duì)豐度為2.2%，隨后逐漸成為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，尤其在NT第10天相對(duì)豐度達(dá)到66.9%，20 d降至53.62%，TT中分別為19.28%和16.76%；Acetobacter在NT中由第10天相對(duì)豐度20.5%降到20 d的4.2%，而在TT中由10 d相對(duì)豐度0.047%升高到20 d的4.86%。

TT與NT發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)真菌屬群落間差異顯著。其中嗜熱子囊菌(Thermoascus)、曲霉(Aspergillus)、根毛霉(Rhizomucor)、根霉(Rhizopus)為NT、TT大曲的優(yōu)勢(shì)真菌(圖4-b)。絲孢畢赤酵母(Hyphopichia)和假絲酵母(Candida)在第0天時(shí)占據(jù)主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度分別為68.2%和15%，隨后不斷降低，20 d 時(shí)在NT中的相對(duì)豐度分別為2.1%、5.5%，而在TT大曲中僅為0.3%、0.2%。值得注意的是，Thermoascus是TT大曲發(fā)酵中后期的主要優(yōu)勢(shì)真菌，10 d時(shí)相對(duì)豐度達(dá)到95.72%，20 d時(shí)降至26.7%；在NT 10 d時(shí)僅為0.3%，20 d時(shí)提升至22.7%，是NT大曲后期的主要優(yōu)勢(shì)真菌。Aspergillus、Rhizomucor、Rhizopus

a-細(xì)菌屬水平；b-真菌屬水平；c-細(xì)菌群落PCoA；d-真菌群落PCoA
圖4 不同培曲工藝大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及PCoA
Fig.4 Microbial community structure and PCoA of Daqu produced with different culture techniques

在第0天相對(duì)豐度分別為0.08%、0.01%、0.1%，并隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。Aspergillus在發(fā)酵第20天 時(shí)相對(duì)豐度分別為TT 68.1%、NT 39.6%，是2種大曲發(fā)酵后期的主要優(yōu)勢(shì)真菌。Rhizomucor、Rhizopus則主要在NT大曲中占據(jù)主導(dǎo)地位，第20天時(shí)相對(duì)豐度為50.6%與13.8%(NT)遠(yuǎn)高于TT大曲第20天時(shí)相對(duì)豐度3.6%與0.8%(TT)。

基于Weighted UniFrac距離主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)(圖4-c、圖4-d)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的第一主成分得分為64.97%，第二主成分得分為26.97%，前2個(gè)主成分積累得分91.94%(解釋度大于50%)，故可基于圖4-c分析樣品之間細(xì)菌群落差異。0 d時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與TT、NT的10 d、20 d差異顯著，而TT與NT細(xì)菌群落間無(wú)明顯差異，但TT 10 d與TT 20 d、NT 10 d與NT 20 d的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相近。對(duì)于真菌群落結(jié)構(gòu)，第一主成分得分48.63%，第二主成分得分為35.22%，前2個(gè)主成分積累得分83.85%，解釋度大于50%。樣品0 d、TT與NT三者之間差異顯著，其中TT 10 d與TT 20 d傾向聚為一簇，而NT 10 d與NT 20 d間并沒有明顯的成簇。

2.5 大曲微生物群落與環(huán)境因子、大曲理化指標(biāo)間的RDA

將大曲樣品中主要細(xì)菌屬、真菌屬與大曲的糖化力、液化力、酯化力、纖維素酶活力、酸性蛋白酶活力5個(gè)酶活力及酸度、含水量、品溫、曲房溫度4個(gè)理化指標(biāo)進(jìn)行RDA，如圖5所示。

如圖5-a所示，第一與第二主軸分別解釋了主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度變化的86.11%和8.28%，總解釋度為94.39%，圖5-b中，第一與第二主軸分別解釋了主要真核生物群落相對(duì)豐度變化的46.16%與28.9%，總解釋度為75.06%，說明微生物在屬水平上的分布與理化指標(biāo)及酶活力之間關(guān)系密切。

大曲酸度、品溫、曲房溫度的變化與Lactobacilus、Acetobacter、Bacillus、Thermoascus、Aspergillus、Rhizomucor和Rhizopus呈正相關(guān)，與Weissella、Hyphopichia和Candida呈負(fù)相關(guān)；而含水量與上述菌群的相關(guān)性和酸度、品溫等的相反(圖5)。酸性蛋白酶活力和液化力主要與細(xì)菌屬Lactobacilus、Acetobacter呈正相關(guān)；在真菌屬中Aspergillus、Rhizopus與酸性蛋白酶活力呈正相關(guān)，液化力主要與Candida、Rhizopus和Hyphopichia呈正相關(guān)。酯化力、糖化力主要與細(xì)菌屬Weissella及真菌屬Hyphopichia、Candida呈正相關(guān)；纖維素酶活力主要與細(xì)菌屬Weissella呈負(fù)相關(guān)、與真菌屬Aspergillus、Rhizopus呈正相關(guān)。

a-細(xì)菌群落；b-真菌群落
圖5 大曲微生物群落與酶活力、理化指標(biāo)冗余分析
Fig.5 Redundancy analyses between microbial community and enzyme activity and physicochemical indices in Daqu
注：優(yōu)勢(shì)菌群為藍(lán)色線、酶活力為紅色線、理化指標(biāo)為綠色線

3 討論

為解決特香型大曲前期發(fā)酵上霉過快、中后期品溫下降迅速的問題，本文采取NT，即延遲覆蓋稻草和推遲翻曲時(shí)間。與TT相比，發(fā)酵前期NT工藝推遲1 d覆蓋稻草、僅翻曲1次，減緩了品溫上升速度；發(fā)酵后期NT再經(jīng)歷第2、3次翻曲，減緩了品溫下降速度，高溫期得到延長(zhǎng)，而曲坯后期堅(jiān)挺的品溫有利于曲香生成[19]。

微生物量碳氮常作為土壤微生物生物量及土壤肥力的檢測(cè)指標(biāo)[20]，本文首次嘗試將該檢測(cè)方法用于大曲的微生物生物量分析。由于NT品溫前期低于TT，微生物量碳、氮均低于TT，但在15 d后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，微生物生物量高于TT。即NT較TT前期微生物生長(zhǎng)減慢，后期生長(zhǎng)優(yōu)于TT。

培曲工藝調(diào)整后，微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。NT的真菌豐度、多樣性高于TT，而細(xì)菌則相反，TT高于NT。0 d時(shí)因曲坯制作過程中添加丟糟，Weissella、Hyphopichia和Candida占據(jù)主導(dǎo)地位，隨后NT在10 d時(shí)Lactobacilus、Aspergillus、Hyphopichia和Rhizopus相對(duì)豐度高，而TT則是Weissella、Lactobacilus、Thermoascus相對(duì)豐度高，特別是Thermoascus高達(dá)95.72%，推測(cè)與品溫關(guān)系密切，此時(shí)TT正處于高溫發(fā)酵階段。在20 d時(shí)，NT中的真菌是Thermoascus、Rhizomucor、Rhizopus相對(duì)豐度偏高，TT是Thermoascus、Aspergillus偏高。

LI等[2]發(fā)現(xiàn)微生物群落替代與白酒發(fā)酵過程中物理化學(xué)參數(shù)的變化密切相關(guān)。有研究表明Candida具有分泌酯酶的能力[21]；Hyphopichia存在于傳統(tǒng)發(fā)酵中，是酵母屬的一種具有產(chǎn)香氣的能力，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的形成有潛在的作用[22-23]；酸性蛋白酶活力與Aspergillus、Rhizopus與呈正相關(guān)[24]。NT的酸性蛋白酶活力在發(fā)酵10～15 d達(dá)到最大值，隨后下降，而TT從10 d開始下降，20 d后上升，其變化趨勢(shì)與Aspergillus、Rhizopus菌群相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)一致。大曲的液化力主要與Lactobacilus、Acetobacter、Candida、Rhizopus、Hyphopichia呈正相關(guān)，這與NT大曲在10 d時(shí)上述菌群相對(duì)豐度顯著高于TT有關(guān)。據(jù)報(bào)道Bacillus是醬香大曲的核心菌群，同樣也存在于特香型大曲中，其主要功能是產(chǎn)生蛋白水解酶、淀粉酶、有機(jī)酸等[19,25]，它與溫度、酸度呈正相關(guān)而與水分呈負(fù)相關(guān)，具有抵抗和耐受熱、酸、干旱等能力[26-27]。Lactobacilus被認(rèn)為是一種專性異養(yǎng)發(fā)酵屬，是谷物發(fā)酵中所必需的屬[28]，也是濃香型白酒發(fā)酵中的標(biāo)志微生物[29]。上述這些屬被認(rèn)為是具有降解功能的群體，可以生產(chǎn)各種水解酶和香味物質(zhì)[30]。NT大曲在纖維素酶活力、糖化力、液化力、酸性蛋白酶活力均顯著高于TT工藝的大曲，與微生物生物量、微生物群落結(jié)構(gòu)不同于TT有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過調(diào)整特香型培曲工藝，使大曲發(fā)酵過程中曲溫呈現(xiàn)前緩、后堅(jiān)挺，大曲微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。NT大曲的優(yōu)勢(shì)真菌種類與相對(duì)豐度較常規(guī)大曲更為豐富與均衡，纖維素酶、酸性蛋白酶、液化力、糖化力均高于后者。本研究結(jié)果有利于推動(dòng)培曲工藝的技術(shù)升級(jí)及大曲質(zhì)量提高，為特香型白酒釀造控制工藝提供理論參考。