抑制食源性致病菌脂肽的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

芽孢桿菌是一類能夠耐受極端惡劣環(huán)境的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，能夠產(chǎn)生20多種不同類型的抗菌化合物[1]，根據(jù)抗菌物質(zhì)生物合成機(jī)制可分為核糖體合成的細(xì)菌素和非核糖體合成的抗菌肽[2]。細(xì)菌素是細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌多肽，不同來(lái)源的細(xì)菌素其抑菌譜不同，迄今已經(jīng)分離鑒定了一些細(xì)菌素，如枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的枯草菌素和枯草桿菌素A[3]，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的凝固素[4]；蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的Bacthuricin F4和系列蘇云金素[5]，地衣芽孢桿菌P40和蠟樣芽胞桿菌ATCC 4579產(chǎn)生的類細(xì)菌素物質(zhì)[6]。雖然已經(jīng)鑒定出多種細(xì)菌素，且由乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素和由嗜酸片球菌產(chǎn)生的片球菌素PA-1已在食品工業(yè)中商業(yè)化使用，但其在抗菌譜及穩(wěn)定性方面還存在局限，故開(kāi)發(fā)芽孢桿菌中的另一類抗菌物質(zhì)——脂肽具有現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。脂肽類化合物包括芬芥素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、表面活性素家族，其主要由1個(gè)肽環(huán)和脂肪酸鏈組成，是一類具有親水親油特性的化合物[7]。因其具有廣泛的生物活性如廣譜抗細(xì)菌、抗病毒、抗霉菌、抗癌和免疫抑制等[8]，并具有影響細(xì)胞膜通透性并最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂菌體死亡的特定機(jī)制，在生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥治療和食品健康等方面具有潛在的利用價(jià)值，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。

表面活性素主要是芽孢桿菌屬細(xì)菌所產(chǎn)生的一類重要環(huán)狀脂肽[9]，包含多種同系物和同分異構(gòu)體，如表面活性素(surfactin)、普米拉西丁(pumilacidin)和地衣菌素(lichenysin)，它們因其脂肪酸鏈長(zhǎng)度和分支變化以及肽環(huán)中的氨基酸不同而有差異。表面活性素除了具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌功能外，還具有溶血、抗凝血和抗腫瘤等活性，其活性與它們與生物大分子的相互作用有關(guān)[10]。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)表面活性素的研究較多，但主要圍繞表面活性和植物病蟲(chóng)害防治方面。近年來(lái)脂肽在食品防腐領(lǐng)域也有一些報(bào)道，但存在抗菌譜窄、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低等各種缺陷，限制了脂肽在食品防腐領(lǐng)域的應(yīng)用。脂肽在芽孢桿菌屬細(xì)菌中廣泛存在，不同的芽孢桿菌所產(chǎn)生的脂肽其結(jié)構(gòu)和抑菌特性往往不同，故深入挖掘產(chǎn)脂肽菌種資源，尋找新的脂肽并研究其特性對(duì)開(kāi)發(fā)天然安全健康的食品防腐劑具有重要意義。

在本研究中，我們從中國(guó)傳統(tǒng)香腸中分離出1種產(chǎn)脂肽的菌株XZK-18，對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定，從其發(fā)酵液中分離純化抗菌脂肽，并鑒定脂肽類別，研究脂肽的抑菌機(jī)理、理化特性及抗菌譜，為開(kāi)發(fā)新型天然防腐劑、保障消費(fèi)者的飲食健康奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品、培養(yǎng)基與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

分離篩選產(chǎn)生抗菌脂肽菌株的樣品取自江蘇省睢寧縣農(nóng)村傳統(tǒng)方法自制香腸。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基，g/L)：NaCl 10，酵母提取物5，胰蛋白胨10，調(diào)pH至7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20，蛋白胨10，NH4NO32，KH2PO4 3，Na2HPO4 2，MgSO4 0.2，酵母膏0.2，CaCl2 0.000 7，MnSO4 0.001，pH自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TC-C18高效液相色譜半制備柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、1100 series高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；AKTA EXPLORER蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare公司；Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SHB-Ⅲ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GeneAmp 9700 PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)抗菌脂肽芽孢桿菌的篩選

稱取香腸20 g，切成1 cm長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移至裝有180 mL無(wú)菌水的勻漿機(jī)中，經(jīng)充分勻漿后靜置10 min，吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的勻漿液100 μL涂布于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2～4 d，氯仿熏蒸法篩選拮抗菌株[11]。瓊脂孔擴(kuò)散法[11]檢測(cè)發(fā)酵液抑菌活性，挑選1株抑菌活性較強(qiáng)、抑菌譜廣的菌株深入研究。

1.2.2 菌株形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

篩選到的菌株在牛肉膏蛋白胨平板上劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的顏色、形狀、光滑度等指標(biāo)，并進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征和產(chǎn)芽孢情況。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析鑒定

16S rRNA序列擴(kuò)增采用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包含有1 μL DNA模板，引物(10 μmol/L)各1 μL，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.3 μL Tap DNA polymerase和17.2 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：95 ℃下3 min，95 ℃下30 s，55 ℃下30 s，72 ℃下1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR的產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。PCR產(chǎn)物測(cè)序后，將16 S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。選取相相似度高的相關(guān)菌株序列，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列匹配分析并采用Neighbour-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行1 000次的Bootstrap檢驗(yàn)。

1.2.3 抗菌脂肽的發(fā)酵

取甘油保藏的菌株用接種環(huán)挑取1環(huán)進(jìn)行平板劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取平板上的單菌落至LB瓊脂斜面，靜置培養(yǎng)24 h。挑取斜面菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，即為種子液。按照2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃下180 r/min振蕩發(fā)酵48 h。每隔2～4 h，取3 mL發(fā)酵液檢測(cè)OD600吸光值以及所產(chǎn)脂肽對(duì)蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以抑菌圈直徑大小表示抑菌活性高低。

1.2.4 抗菌脂肽的分離純化

1.2.4.1 抗菌脂肽粗提

將上述發(fā)酵48 h的發(fā)酵液于-4 ℃的環(huán)境下8 000 r/min離心15 min；取上清液用6 mol/L的HCl溶液將上清液調(diào)至pH 2.0，靜置過(guò)夜；8 000 r/min離心，取沉淀，用甲醇抽提3次，8 000 r/min 離心10 min；上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器50 ℃減壓濃縮，得到脂肽粗提物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 抗菌脂肽Sephadex LH-20層析

Sephadex LH-20柱層析純化脂肽參照文獻(xiàn)[12]方法并稍微改動(dòng)。凝膠干粉用去離子水充分溶脹后，利用重力沉降原理裝填入15 mm×800 mm 層析柱中，50%甲醇充分平衡；脂肽粗提物溶解于50%甲醇中，并通過(guò)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾后上樣于Sephadex LH-20色譜柱，洗脫緩沖液為50%甲醇，流速為1 mL/min，每管收集3 mL，瓊脂孔擴(kuò)散法分析檢測(cè)每個(gè)洗脫峰的抑菌活性。多個(gè)循環(huán)洗脫后，將活性組分混合并用50 ℃的吹氮儀干燥。

瓊脂孔擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性具體為在LB瓊脂平板上均勻涂布150 μL過(guò)夜培養(yǎng)好的濃度為1×107CFU/mL的指示菌菌液，表面晾干后以6 mm直徑的打孔器平板上打孔，取相同量的收集液注入孔中，37 ℃培養(yǎng)12～18 h后查看抑菌圈情況并測(cè)定抑菌圈直徑，以該直徑表示抑菌活性大小。

1.2.4.3 抗菌脂肽半制備反向高效液相色譜(reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)法分離純化

將經(jīng)Sephadex LH-20分離獲得的活性組分進(jìn)一步使用RP-HPLC法純化，具體參照文獻(xiàn)[13]方法。流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)水溶液，流動(dòng)相B：0.1% TFA乙腈。洗脫速度：2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。梯度洗脫條件：0～60 min內(nèi)溶劑B的線性梯度從10%增加到90%。濾紙片法檢測(cè)各洗脫峰抑菌活性。

1.2.5 抗菌脂肽的鑒定

1.2.5.1 抗菌脂肽薄層色譜分析

經(jīng)酸沉淀并萃取得到的粗提物樣品進(jìn)行薄層層析(thin-layer chromatography,TLC)法分析。具體參照文獻(xiàn)[14]并稍作改動(dòng)。溶解在甲醇中的樣品在硅膠薄層色譜板上點(diǎn)樣，以體積比65∶25∶4的氯仿、甲醇和水的混合溶液為流動(dòng)相展開(kāi)色譜板。展開(kāi)結(jié)束后將色譜板放在封閉的層析缸中碘蒸汽熏蒸，觀察層析板上是否有黃色斑點(diǎn)出現(xiàn)以確定樣品分子中是否有脂質(zhì)存在；另一塊薄層色譜板干燥后，噴灑茚三酮溶液，在110 ℃下烘烤30 min，觀察是否出現(xiàn)粉紅色或紅色斑點(diǎn)，確定是否有肽的存在。測(cè)定所顯示斑點(diǎn)的遷移率(retention factor，Rf)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的特征Rf值比較。

TLC-生物自顯影參照文獻(xiàn)方法[14]。展開(kāi)后的層析板晾干后置于空的滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，倒入60 ℃左右的LB瓊脂培養(yǎng)基，充分凝固后，分別涂布150 μL濃度為1.0×108 CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，表面晾干后置于37 ℃培養(yǎng)箱，12～24 h觀察抑菌圈并測(cè)定抑菌圈Rf值。檢測(cè)對(duì)霉菌的抑制作用，將層析板置于培養(yǎng)皿，覆蓋熔化好的PDA培養(yǎng)基，涂布150 μL濃度為1.0×106個(gè)/mL的黑曲霉分生孢子懸液，表面晾干后28 ℃孵育2～4 d，檢測(cè)培養(yǎng)皿中是否有抑菌圈出現(xiàn)。

1.2.5.2 抗菌脂肽傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)掃描

利用FT-IR推斷經(jīng)過(guò)純化的抑菌活性成分存在的化學(xué)鍵和官能團(tuán)，初步鑒定抑菌成分。光譜數(shù)據(jù)采集范圍為378～4 000 cm-1，光譜分辨率為4.0 cm-1，收集的數(shù)據(jù)是整個(gè)范圍內(nèi)50次掃描的平均值。

1.2.6 掃描電鏡分析細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

掃描電鏡觀察經(jīng)過(guò)脂肽處理后的菌體顯微結(jié)構(gòu)變化，探索脂肽抑菌機(jī)理。參照文獻(xiàn)方法[15]制備菌體樣品，將大腸桿菌37 ℃ LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，按照10%的接種量接種至新的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，取2 mL至離心管，加入純化后的脂肽，37 ℃ 120 r/min搖床振蕩2 h，立即冰浴2 min，4 ℃ 5 000 r/min離心5 min，去上清液，加入100 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液，吹打懸浮，再次離心，倒掉上清液，再次重復(fù)加緩沖液，再離心。倒掉上清液，加入2.5%體積分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液，4 ℃固定過(guò)夜。使用75%～100%的乙醇逐級(jí)脫水，真空冷凍干燥，再將樣品在真空鍍膜機(jī)內(nèi)把金噴鍍到樣品表面，掃描電鏡進(jìn)行觀察。未經(jīng)過(guò)脂肽處理的大腸桿菌作為對(duì)照。

1.2.7 抗菌脂肽抑菌譜測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定脂肽抑菌譜。選擇5株革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、5株革蘭氏陰性細(xì)菌、3株真菌作為指示菌，檢測(cè)脂肽對(duì)這些菌株的抑菌性能。細(xì)菌使用LB瓊脂培養(yǎng)基，真菌使用PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～4 d，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.8 抗菌脂肽穩(wěn)定性

1.2.8.1 熱穩(wěn)定性

將純化后的脂肽分別于70、80、90、100、110、120 ℃ 下各處理30 min，以蠟樣芽胞桿菌為指示菌瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性。

1.2.8.2 酸堿穩(wěn)定性

將純化的脂肽用1.2 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液分別調(diào)pH至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，4 ℃處理1～10 d，再調(diào)pH至7.0，以蠟樣芽胞桿菌為指示菌瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行誤差分析。脂肽抑菌活性測(cè)定中，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行樣，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用t-檢驗(yàn)顯著性分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肽菌株篩選鑒定

篩選得到1株抑菌活性較強(qiáng)的菌株XZK-18，其發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌抑菌活性如圖1所示，對(duì)2種菌株均產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后菌落呈圓形、邊緣整齊、乳白色、表面不光滑有褶皺、不透明。油鏡下觀察，革蘭氏陽(yáng)性，菌體形態(tài)呈桿狀，兩短鈍圓，芽孢呈橢圓形中生。生理生化試驗(yàn)顯示，明膠液化、接觸酶試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)、淀粉水解、H2S試驗(yàn)為陰性，能利用阿拉伯糖、D-山梨醇、纖維二塘、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，不能利用α-乳糖、D-木糖、D-甘露糖，可在7%～10%的含鹽培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。根據(jù)典型的生理生化特征初步確定菌株XZK-18為短小芽孢桿菌。

CK-磷酸緩沖溶液為空白對(duì)照
a-金黃色葡萄球菌；b-蠟樣芽胞桿菌
圖1 菌株XZK-18發(fā)酵液的抑菌活性
Fig.1 Antibacterial activity of the fermentation broth of strain XZK-18

菌株16S rRNA擴(kuò)增到大小約1 500 bp的PCR特征性條帶，測(cè)序結(jié)果在GenBank中與己知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與短小芽孢桿菌SAFR-032的16 S rRNA一致性為100%。以菌株XZK-18的16 S rRNA序列與相近序列的比對(duì)，通過(guò)MEGA 6.0軟件軟件進(jìn)行多序列匹配分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示，菌株XZK-18與Bacillus pumilus SAFR-032在同一個(gè)分支上(圖2)，綜合形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定XZK-18為短小芽孢桿菌。芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道了大量產(chǎn)脂肽的不同類型的芽孢桿菌屬菌株如解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)[16]等，但大多脂肽研究主要圍繞其表面活性劑特性或者在生物防治中的抗真菌特性，本研究的脂肽前期篩選中使用了大量細(xì)菌指示菌株，主要目的是篩選應(yīng)用于食品防腐的抗細(xì)菌脂肽產(chǎn)生菌株，篩選到的短小芽孢桿菌XZK-18是1株有應(yīng)用潛力的廣譜細(xì)菌拮抗菌株。

圖2 菌株XZK-18 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)
Fig.2 Phylogenetic tree of strain XZK-18 16S rRNA

2.2 抗菌脂肽發(fā)酵制備

為了研究抗菌脂肽產(chǎn)量變化與細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)連續(xù)48 h測(cè)定菌株XZK-18 OD600值與其發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)圖3。培養(yǎng)至8 h后，發(fā)酵上清液開(kāi)始對(duì)2種指示菌表現(xiàn)出抑菌活性，在8～24 h，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌活性增強(qiáng)。培養(yǎng)24 h后，抑菌活性達(dá)到最大，并隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)抑菌活性保持不變，直到48 h。菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽對(duì)蠟狀芽孢桿菌抑菌活性相對(duì)金黃色葡萄球菌要高。對(duì)照細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，脂肽合成主要在對(duì)數(shù)期的末期大量合成，并在穩(wěn)定期前期達(dá)到峰值，穩(wěn)定期脂肽抑菌活性基本無(wú)變化，整體看出脂肽合成同菌體的生長(zhǎng)呈現(xiàn)部分相關(guān)性，這與GONZLEZ-JARAMILLO等[17]報(bào)道的脂肽合成曲線相類似；而B(niǎo)ALAN等[18]研究的Aneurinibacillus aneurinilyticus SBP-11脂肽同菌體生長(zhǎng)曲線完全吻合，呈現(xiàn)典型的初級(jí)代謝產(chǎn)物合成特性。菌株XZK-18脂肽合成曲線看出，在穩(wěn)定期后期，脂肽活性沒(méi)有降低，而肽類抑菌物質(zhì)細(xì)菌素往往后期活性會(huì)顯著降低，間接這證實(shí)菌株XZK-18所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不是細(xì)菌素。

圖3 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽合成和菌體生長(zhǎng)曲線
Fig.3 Antimicrobial substance synthesis and growth curve of Bacillus pumilus XZK-18

2.3 抗菌脂肽的薄層層析及生物自顯影

為初步確定抗菌物質(zhì)的種類，用碘蒸汽和茚三酮顯色對(duì)抗菌脂肽TLC分析，結(jié)果如圖4所示，碘蒸氣熏蒸后的層析板出現(xiàn)多個(gè)黃色斑點(diǎn)，其中3個(gè)斑點(diǎn)較為明顯，對(duì)應(yīng)Rf值分別為0.78、0.50和0.11(見(jiàn)圖4-a)，其中Rf值得為0.78的斑點(diǎn)顯色最為強(qiáng)烈，說(shuō)明對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)分子中含有脂質(zhì)[19]；茚三酮噴灑后在對(duì)應(yīng)相同的位置也出現(xiàn)了3個(gè)明顯的粉紅色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)強(qiáng)弱程度同碘蒸氣熏蒸板斑點(diǎn)相一致，證明分子中含有氨基酸的存在。由以上可以判斷樣品中至少含有3種類型的化合物且分子由肽和脂質(zhì)組成，推測(cè)屬于脂肽類。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20]，Rf值為0.5和0.78的脂肽屬于表面活性素，這分別與SRIRAM等[21]報(bào)道的Bacillus cereus NK1脂肽表面活性素(surfactant)(0.52)相接近，表面活性素是芽孢桿菌屬一種典型的脂肽類，具有較大的抗細(xì)菌活性；對(duì)比文獻(xiàn)[22]Rf值0.11的脂肽屬于伊枯草菌素類，含量較低。

分別以革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌為指示菌通過(guò)TLC-生物自顯影分析建立脂肽與其抑菌活性的直接關(guān)系，進(jìn)一步確定脂肽化合物的分子類型。結(jié)果表明，所有斑點(diǎn)對(duì)霉菌均沒(méi)有抑制作用，但Rf值0.78對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)對(duì)兩種細(xì)菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且抑制活性較強(qiáng)(如圖4-c～圖4-d)，這同文獻(xiàn)報(bào)道的芬芥素和伊枯草菌素脂肽對(duì)應(yīng)的抑菌帶(Rffen=0.1～0.2，Rfitu=0.3～0.4)不同[14]，但與SRIRAM等[21]報(bào)道的表面活性素脂肽(Rfsrf=0.7)對(duì)大腸桿菌的抑菌情況相類似。Rf值為0.11的，沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)真菌指示菌的抑菌活性，這有可能是因?yàn)榫w合成量偏低所至，從層析板所顯示的較弱的斑點(diǎn)也可以證實(shí)。綜上可知，發(fā)酵液的抑菌活性可能主要源于芽孢桿菌合成的表面活性素。

a-碘熏蒸；b-茚三酮顯色；c-大腸桿菌；d-金黃色葡萄球
圖4 短小芽孢桿菌XZK-18脂肽TLC和TLC-生物自顯影分析
Fig.4 TLC and TLC-bioautographic analysis of lipopeptides from Bacillus pumilus XZK-18

2.4 抗菌脂肽的分離純化

經(jīng)酸沉淀甲醇萃取后的樣品進(jìn)一步葡聚糖凝膠Sephadex LH-20層析，洗脫曲線如圖5-a所示，共得到4個(gè)洗脫峰，分別命名為組分F1、F2、F3、F4。對(duì)各個(gè)峰的收集液抑菌活性檢測(cè)(圖5-b)，僅檢測(cè)到吸收峰F2處收集液有明顯抑菌活性，因此判斷洗脫峰F2為活性峰，收集活性洗脫液，進(jìn)一步通過(guò)RT-HPLC純化。

a-Sephadex LH-20層析；b-抑菌活性檢測(cè)
圖5 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽Sephadex LH-20層析
Fig.5 Sephadex LH-20 chromatography of Bacillus pumilus XZK-18 antibacterial substance

經(jīng)Sephadex LH-20純化的得到的洗脫峰F2活性樣品再通過(guò)RP-HPLC層析純化，得到的洗脫曲線如圖6-a所示，洗脫出9個(gè)比較大的吸收峰，對(duì)每個(gè)洗脫峰檢測(cè)抑菌活性，如圖6-b所示，P4洗脫峰有顯著的抑菌活性，P6洗脫峰僅顯示略微的抑菌圈。進(jìn)一步證實(shí)短小芽孢桿菌XZK-18菌株可以產(chǎn)生不止1種脂肽，這與文獻(xiàn)報(bào)道的脂肽通常以多種亞型或同系物的形式存在相一致[9]，特別是報(bào)道的一些芽孢桿菌屬細(xì)菌更為普遍，如解淀粉芽孢桿菌SR1所產(chǎn)抗菌脂肽為表面活性素，同時(shí)含有伊枯草菌素和芬芥素[18]；B.amyloliquefaciens PGPBacCA1在核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)和茄病鐮刀菌(Fusarium solani)存在的情況下同時(shí)產(chǎn)生不同的脂肽同系物表面活性素、伊枯菌素和芬芥素[23]；Bacillus sp.SL-6其發(fā)酵液中檢測(cè)到4種芬芥素A和2種芬芥素B。整體顯示，本研究脂肽分離純化中先通過(guò)Sephadex LH-20初步純化，去除對(duì)后續(xù)純化影響較大的色素及大分子等雜質(zhì)成分，再使用RP-HPLC將物質(zhì)按照極性強(qiáng)弱分開(kāi)，得到活性組分P4，分離效果好，可以將絕大部分雜質(zhì)同脂肽分離，本研究所用分離方法可為脂肽的純化提供借鑒。

a-RP-HPLC洗脫曲線；b-抑菌活性檢測(cè)
圖6 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽RP-HPLC純化
Fig.6 Purification of antibacterial substance of Bacillus pumilus XZK-18 by RP-HPLC

2.5 脂肽類抑菌成分的FT-IR分析

菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽FT-IR分析如圖7所示，在3 432.74、3 387.36 cm-1的吸收峰是由N—H拉伸模式產(chǎn)生[15]，在1 646.18 cm-1處強(qiáng)烈的吸收譜帶為CO—N鍵的拉伸模式產(chǎn)生，而在1 541.26 cm-1的吸收峰是由于N—H鍵結(jié)合C—N鍵的變形模式產(chǎn)生，由此確定抗菌物質(zhì)分子中存在多肽結(jié)構(gòu)。在2 957.54～2 861.34 cm-1和1 402.30～1 205.22 cm-1處的吸收峰是由于的C—H拉伸模式產(chǎn)生，由此確定分子中存在脂肪酸鏈。而且1 724.17-1處的譜帶是由于內(nèi)酯羰基吸收而形成，說(shuō)明分子中含有環(huán)肽結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果有力表明，該抗菌物質(zhì)含有有脂肪烴和肽片段。經(jīng)分離純化的脂肽FT-IR與文獻(xiàn)報(bào)道的環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的表面活性素分子的特征有明顯的相似性[16]，由此進(jìn)一步證實(shí)短小芽孢桿菌XZK-18所產(chǎn)抗菌脂肽主要為表面活性素。

圖7 短小芽孢桿菌XZK-18抗菌脂肽FT-IR掃描
Fig.7 FT-IR of antimicrobial substance of Bacillus pumilus XZK-18

2.6 大腸桿菌經(jīng)脂肽處理后的掃描電鏡

未經(jīng)脂肽處理和經(jīng)脂肽處理后的大腸桿菌掃描電鏡如圖8所示，未經(jīng)處理的大腸桿菌具有完整的生物膜結(jié)構(gòu)，菌體飽滿、表面光滑(圖8-a)，而用純化脂肽處理2 h后的大腸桿菌與未處理的對(duì)照菌株比較發(fā)現(xiàn)，脂肽致使菌體表面形成孔洞，其周圍細(xì)胞膜向內(nèi)塌陷，而且孔多分布在菌體頭部(圖8-b)，部分菌體收縮變形，表面不平整，這表明脂肽對(duì)菌體細(xì)胞壁細(xì)胞膜有破壞作用。推測(cè)，菌株XZK-18所產(chǎn)表面活性素對(duì)大腸桿菌等敏感細(xì)胞的殺菌或抑菌作用，是因其致使菌體細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞內(nèi)容物向外滲漏，致使菌體死亡，這是其抑菌作用的主要作用機(jī)制，這與文獻(xiàn)報(bào)道的脂肽家族中的表面活性素殺菌機(jī)制相吻合[18]，有力證實(shí)了短小芽孢桿菌XZK-18所產(chǎn)脂肽主要為表面活性素。SONG等[24]報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌R3所產(chǎn)表面活性素對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜也有類似的破壞作用。細(xì)胞膜是細(xì)菌自產(chǎn)的胞外聚合物，可以使菌體更好地適應(yīng)外界環(huán)境，增加其自身毒性和增強(qiáng)對(duì)外界抗生素或病毒的抗性。在食品工業(yè)中，食源性致病菌或腐敗菌容易附著在設(shè)備表面形成生物膜，特別是在難以直接清洗接觸到的設(shè)備部件位置，難以徹底清洗，容易引起交叉污染，帶來(lái)嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。脂肽通過(guò)生物膜的破壞作用殺滅病原菌，這在食品防腐及醫(yī)藥應(yīng)用中具有重要應(yīng)用前途。

a-未經(jīng)脂肽處理；b-經(jīng)脂肽處理
圖8 大腸桿菌經(jīng)脂肽處理前后的掃描電鏡
Fig.8 Scanning electron microscopes of untreated and treated with lipopeptide

2.7 脂肽抗菌譜檢測(cè)

在本研究中，選用了13株指示菌，其中5株革蘭氏陰性菌，5株革蘭氏陽(yáng)性菌，3株真菌。其中大多數(shù)為食源性致病菌或腐敗菌，如金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、傷寒沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等。瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性顯示，孔周圍出現(xiàn)了大小不等的顯著的抑菌圈，具體大小如表1所示。菌株XZK-18所產(chǎn)脂肽對(duì)所有細(xì)菌均具有抑菌活性，其中對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果最為明顯，尤其是金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌抑菌活性最強(qiáng)，其抑菌圈直徑達(dá)到22 mm以上。對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的抑菌效果，抑菌圈直徑在13～21 mm。對(duì)比脂肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的抑菌活性，存在顯著性差異(P<0.05)。脂肽對(duì)白色念珠菌、畢赤酵母、黑曲霉等真菌的抑菌活性同空白對(duì)照(磷酸緩沖溶液)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明無(wú)抑菌活性。推測(cè)脂肽對(duì)不同類型的微生物的抑菌活性與細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)構(gòu)成有重要關(guān)系。脂肽對(duì)細(xì)菌的抑制作用多有報(bào)道，如韋露等[25]研究報(bào)道的1株短小芽孢桿菌B1對(duì)溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌、哈氏弧菌等水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌有抑制作用，但同樣對(duì)例如金黃色葡萄球菌的食源性病原性無(wú)抑制作用。而本研究脂肽在抑制食源性致病菌腐敗菌方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，有潛力作為生物防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)中，減少化學(xué)合成防腐劑的使用，延長(zhǎng)食品保貨架期。

表1 短小芽孢桿菌XZK-18脂肽抑菌譜
Table 1 Antimicrobial spectrum of Bacillus pumilus XZK-18 lipopeptide

2.8 抗菌脂肽穩(wěn)定性分析

2.8.1 抗菌脂肽熱穩(wěn)定特性

脂肽熱穩(wěn)定性如圖9所示，在70～100 ℃保溫30 min脂肽抑菌抑菌活性基本無(wú)變化，差異顯著性分析表明，70～100 ℃處理后的脂肽抑菌圈同磷酸緩沖液空白對(duì)照沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明70～100 ℃脂肽耐熱性較好。110 ℃ 30 min后抑菌活性略微減少，但加熱至120 ℃ 30 min后，抑菌活性明顯下降，但仍能看出顯著的抑菌活性?？梢?jiàn)脂肽在110 ℃以下耐熱性較好。不同來(lái)源的脂肽其熱穩(wěn)定性區(qū)別較大，如BEN AYED等[26]報(bào)道的莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis A21)脂肽也具有良好的熱穩(wěn)定性，但其在90、100 ℃保溫15 min抑菌活性就開(kāi)始出現(xiàn)下降。脂肽良好的耐熱性使其應(yīng)用范圍更為廣泛，可以在更為極端的熱環(huán)境下使用。食品工業(yè)防腐中，使用單一的抗菌物質(zhì)很難確保完全的防腐效果，故通常將1種抗菌物質(zhì)和其他幾種抗菌化合物或抗菌技術(shù)聯(lián)合使用，例如適當(dāng)?shù)臒嵯?、脈沖電場(chǎng)、射線消毒等，本研究脂肽完全能夠承受食品加工過(guò)程中的巴氏殺菌等熱處理過(guò)程。

圖9 不同溫度對(duì)抗菌脂肽抑菌活性的影響
Fig.9 Effects of different temperatures on antibacterial activity of antimicrobial lipopeptid

2.8.2 抗菌脂肽酸堿穩(wěn)定性

在惡劣的貯存環(huán)境下具備良好的穩(wěn)定性是脂肽開(kāi)發(fā)應(yīng)用的重要前提。脂肽酸堿穩(wěn)定性情況如圖10所示，抗菌脂肽在pH 5～9環(huán)境下保存1～10 d相對(duì)抑菌活性都處在85%以上，具有較穩(wěn)定的抑菌活性；而pH在3.0和11.0時(shí)，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌活性均出現(xiàn)降低，但貯存10 d抑菌活性仍然在70%以上。因此脂肽具有非常好的酸堿穩(wěn)定性，與李旭等[27]報(bào)道的枯草芽孢桿菌抗菌脂肽酸堿穩(wěn)定性類似。但不同來(lái)源的脂肽酸堿抑菌穩(wěn)定性區(qū)別較大，陸雅琴等[28]報(bào)道的芽孢桿菌P6抗菌脂肽在pH>9.0時(shí)抑菌活性喪失，但李紅曉等[29]研究的解淀粉芽孢桿菌MH71脂肽在pH 5～11的環(huán)境下抑菌活性較強(qiáng)，pH<4時(shí)穩(wěn)定性顯著下降。整體看，脂肽在寬泛的pH范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，有潛力在不同酸堿度的食品中使用。

圖10 不同pH對(duì)抗菌脂肽抑菌活性的影響
Fig.10 Effect of different pH on antibacterial activity of antimicrobial lipopeptid

3 結(jié)論

本研究從徐州市睢寧縣農(nóng)村自制香腸中分離到1株對(duì)多種食源性病原菌有抑菌活性的短小芽孢桿菌XZK-18。菌株發(fā)酵液中提取的抗菌物質(zhì)經(jīng)TLC及TLC-生物自顯影分析確定為脂肽類混合物，包括表面活性素和伊枯草菌素。分離純化的脂肽不僅可以抑制致病性的革蘭氏陽(yáng)性菌如蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和單核增生李斯特菌，還對(duì)容易引起人類重大疾病的革蘭氏陰性菌如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和福氏志賀氏菌也有抑制作用，故該脂肽有潛力開(kāi)發(fā)為食品防腐劑，抑制食源性致病菌；同時(shí)可以在醫(yī)藥領(lǐng)域中使用。掃描電鏡顯示脂肽通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性、使細(xì)胞壁穿孔、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)殺滅大腸桿菌。脂肽良好的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性和廣譜殺菌活性表明其在多種工業(yè)領(lǐng)域如環(huán)境生物修復(fù)、制藥、生物防治、化妝品、飼料和食品加工等多個(gè)行業(yè)特別是食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。