搖床T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶流體力學(xué)與傳質(zhì)特性研究

引 言

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是生物技術(shù)的一個(gè)重要分支，是現(xiàn)代生物醫(yī)藥的支柱。現(xiàn)有的治療性生物制品超過50%在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。2018年，基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的診療產(chǎn)品產(chǎn)值約為2372億美元，預(yù)計(jì)2024年增長(zhǎng)至3890億美元[1]。隨著細(xì)胞培養(yǎng)工藝的日漸成熟，近年來又有新的應(yīng)用領(lǐng)域被開發(fā)出來，如細(xì)胞培養(yǎng)肉技術(shù)[2]。在這種背景下，越來越多的研究人員開始關(guān)注動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)研究。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常在孔板、方瓶和轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行[3]。其中孔板和方瓶主要用于靜置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶主要用于懸浮培養(yǎng)。相對(duì)于靜置培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)可以達(dá)到更高的細(xì)胞密度，尤其是對(duì)于貼壁依賴型細(xì)胞，如常用的模式細(xì)胞HEK293[4]，某些CHO細(xì)胞系，以及牛[5]或者豬肌肉干細(xì)胞[6]等。這些細(xì)胞在孔板或方瓶中單層貼壁培養(yǎng)僅能達(dá)到104~105 cells/cm2，而懸浮培養(yǎng)則可以達(dá)到106~107 cells/ml或更高。在細(xì)胞培養(yǎng)放大過程中，方瓶還常常作為中間步驟用于轉(zhuǎn)瓶或小型攪拌釜反應(yīng)器之前[4]。Zhang等[7]通過分析得出，實(shí)驗(yàn)室常用的Thermo Fisher Scientific T25培養(yǎng)瓶的傳質(zhì)系數(shù)比250 ml轉(zhuǎn)瓶高10倍左右，理論上可以支持更高的細(xì)胞濃度。如果可以在方瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，尤其是加有微載體的懸浮培養(yǎng)，進(jìn)而達(dá)到更高的密度，對(duì)簡(jiǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝、減少放大步驟將有很大的幫助。此外，得益于方瓶的微小體積（T25方瓶最大裝液量不超過10 ml），還可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選，避免靜置培養(yǎng)時(shí)由于混合、傳質(zhì)、剪切等條件與大型反應(yīng)器不同，篩選到不適合大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞系或者培養(yǎng)基[8]。

Fujii等[9]研究了使用超聲波使細(xì)胞在T25培養(yǎng)瓶中懸浮的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在超聲波的作用下懸浮的CHO細(xì)胞增殖1000倍的時(shí)間比靜置培養(yǎng)縮短了14%。然而這種做法需要特殊的超聲波發(fā)生器，較難推廣。事實(shí)上，只要將方瓶置于翹板搖床（或稱“擺床”）之上，就有可能實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，其機(jī)理類似于思拓凡(Cytiva，原GE Healthcare)的波浪式（WAVE?）反應(yīng)器。此類反應(yīng)器出現(xiàn)在20世紀(jì)90年代，是最早的一次性生物反應(yīng)器，如今已廣泛應(yīng)用于從實(shí)驗(yàn)室到中試規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)[10-12]。Zhan等[13]通過計(jì)算流體力學(xué)(CFD)模擬研究了WAVE反應(yīng)器內(nèi)的流體力學(xué)特性，并發(fā)現(xiàn)了特定擺動(dòng)頻率下由于共振現(xiàn)象使混合和傳質(zhì)變差的現(xiàn)象。然而，由于方瓶特征尺寸較小，湍流程度較低，其操作條件與常規(guī)的臺(tái)式波浪反應(yīng)器之間不能簡(jiǎn)單換算，因此有必要針對(duì)T25培養(yǎng)瓶進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本文將傳統(tǒng)上一般用于靜置培養(yǎng)的T25方形培養(yǎng)瓶置于翹板搖床上，對(duì)其傳質(zhì)及混合特性進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，并借助CFD模型對(duì)不同操作條件下的能量耗散和剪切情況進(jìn)行了分析。報(bào)道了不同振蕩頻率下T25方瓶的傳質(zhì)系數(shù)、混合時(shí)間等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為使用該裝置進(jìn)行高密度細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。這將有利于推動(dòng)基于T25方瓶的一次性微型反應(yīng)器開發(fā)，實(shí)現(xiàn)高通量篩選，促進(jìn)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，材質(zhì)為聚苯乙烯，底面積為25 cm2，工作體積7 ml。實(shí)驗(yàn)中所需的磷酸二氫鉀（99%）、氯化鈉（99.8%）、二水合磷酸二氫鈉（99%）和十二水合磷酸氫二鈉（99%），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。溴百里香酚藍(lán)（生物技術(shù)級(jí)），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。氮?dú)?，?gòu)自無錫市鑫錫儀科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。稱取0.072 g磷酸二氫鉀，0.531 g十二水合磷酸氫二鈉和4.5 g氯化鈉于燒杯中，加少量水溶解，轉(zhuǎn)移到容量瓶中并定容至500 ml，配制得到PBS溶液。取5.3 ml的0.2 mol/L的二水合磷酸二氫鈉溶液與94.7 ml的0.2 mol/L的十二水合磷酸氫二鈉溶液混勻，取10 ml混合液加0.1 g溴百里香酚藍(lán)，配制得到示蹤劑溶液。

1.2 分析測(cè)試儀器

光學(xué)溶氧傳感器，SP-PSt3型，德國(guó)PreSens公司；翹板搖床，SLK-R3000-S型，美國(guó)SCILOGEX公司；Q-Flow轉(zhuǎn)子流量計(jì)（0~100 ml/min），瑞士vogtlin。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶冷模實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示，它由翹板搖床、氮?dú)夤┙o系統(tǒng)、空氣供給系統(tǒng)、光學(xué)溶氧傳感器、攝像頭以及T25培養(yǎng)瓶等部分組成。在傳質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，首先通入氮?dú)庖灾脫Q培養(yǎng)瓶中的溶解氧和氣相中的氧氣，之后切換為空氣，記錄液相中溶解氧的變化趨勢(shì)。在混合實(shí)驗(yàn)中，通過攝像頭記錄示蹤劑的混合過程。

圖1

圖1   T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶冷模實(shí)驗(yàn)裝置

Fig.1   Cold-flow experimental setup for the rocking T25 flask micro-reactor system

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 傳質(zhì)系數(shù)

反應(yīng)器的傳質(zhì)性能一般用體積氧傳質(zhì)系數(shù)kLa表征，常用的冷模測(cè)量方法是亞硫酸鹽氧化法，通過亞硫酸鈉和氧發(fā)生反應(yīng)消耗溶解氧進(jìn)行計(jì)算。然而亞硫酸鈉溶液的性質(zhì)與細(xì)胞反應(yīng)體系相差較大，不能反映細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的真實(shí)情況。本實(shí)驗(yàn)使用與細(xì)胞培養(yǎng)體系性質(zhì)接近的PBS溶液和動(dòng)態(tài)充氧法[14-16]。動(dòng)態(tài)充氧法輔助設(shè)備少，操作簡(jiǎn)單，對(duì)體系影響小，可以使用與實(shí)際細(xì)胞培養(yǎng)相同或相近的物系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)有更好的參考價(jià)值。缺點(diǎn)是用于T25培養(yǎng)瓶這類小型反應(yīng)器時(shí)需要微型光學(xué)溶氧傳感器，成本較高。

本研究所用光學(xué)溶氧傳感器基于熒光淬滅作用，感應(yīng)元件為直徑5 mm的玻璃貼片，粘貼于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的底部，使用前根據(jù)制造商說明進(jìn)行了校準(zhǔn)。首先將氮?dú)馔ㄈ隩25培養(yǎng)瓶驅(qū)趕PBS中的溶解氧，當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到零或較低數(shù)值時(shí)，停止通氮?dú)獠⒀杆偾袚Q為空氣，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄溶氧濃度的變化，直至溶氧達(dá)到飽和。在液相理想混合、氣相氧氣濃度為常數(shù)時(shí)，根據(jù)式（1）求得體積氧傳質(zhì)系數(shù)：

C*?CLC*?CL0=e?kLat$\frac{C^{*}-C_L}{C^{*}-C_{L0}}=e^{-k_{L}at}$(1)

其中，C* 為與氣相氧氣分壓對(duì)應(yīng)的飽和溶氧濃度，mg/L,在動(dòng)態(tài)充氧法中，需要將容器內(nèi)氣相快速置換為空氣，才能確定C* 的值；CL0和CL分別為0時(shí)刻和t時(shí)刻實(shí)際測(cè)量的溶氧濃度，mg/L。由于光學(xué)溶氧傳感器的響應(yīng)時(shí)間常數(shù)遠(yuǎn)小于溶氧達(dá)到平衡的時(shí)間[7]，本實(shí)驗(yàn)中忽略傳感器響應(yīng)時(shí)間的影響。

1.4.2 混合時(shí)間

綜合考慮染料的溶解度和顏色強(qiáng)度，選擇溴百里香酚藍(lán)作為示蹤劑。在翹板搖床一定轉(zhuǎn)速下，使T25培養(yǎng)瓶達(dá)到流體力學(xué)擬穩(wěn)態(tài)，用一次性巴氏吸管滴加1滴溴百里香酚藍(lán)溶液，通過固定在翹板搖床上與培養(yǎng)瓶同步運(yùn)動(dòng)的攝像頭以60 幀/秒或120 幀/秒的幀率和640×480分辨率錄制混合過程的視頻。使用Python語(yǔ)言開發(fā)了基于OpenCV的計(jì)算機(jī)視覺算法對(duì)上述視頻進(jìn)行處理。同時(shí)，使用了快速傅里葉變換（FFT）過濾掉由于翹板搖床振蕩引起的干擾。由于溴百里香酚藍(lán)對(duì)紅色光吸收最強(qiáng)烈，算法得到整個(gè)視野內(nèi)所有像素紅色光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差隨時(shí)間變化的曲線。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差不再變化時(shí)，即認(rèn)為混合均勻。本方法不依賴吸光度的絕對(duì)值，具有更高的靈敏度和分辨率。此處獲得的混合時(shí)間還用于后續(xù)計(jì)算流體力學(xué)模型驗(yàn)證。

1.5 計(jì)算流體力學(xué)模型

1.5.1 幾何模型與網(wǎng)格劃分

CFD模型的建立和求解使用了Ansys 2020 R2中的Fluent。T25培養(yǎng)瓶底面積25 cm2，高3.0 cm，頸部具有一定角度。裝液量為10 ml時(shí)，液面高度為0.4 cm，之上為氣相。為了減少網(wǎng)格數(shù)量，提高計(jì)算速度，幾何模型只包含方瓶底部的1.5 cm部分。整個(gè)幾何模型采用六面體結(jié)構(gòu)化網(wǎng)格進(jìn)行劃分，如圖2所示。其中，靠近方瓶底部的液相區(qū)域進(jìn)行了加密處理，以提高模型精度，捕捉更多細(xì)節(jié)。經(jīng)網(wǎng)格無關(guān)性分析，確定最終網(wǎng)格和節(jié)點(diǎn)數(shù)量分別為344×103和362×103。

圖2

圖2   T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶幾何模型及網(wǎng)格劃分

Fig.2   Geometry and meshing of the T25 flask used in the CFD model

1.5.2 數(shù)學(xué)模型

由于T25培養(yǎng)瓶中氣液兩相有明顯的分界面，CFD采用VOF多相流模型。在VOF模型中，不同流體組分共用同一套動(dòng)量方程，僅計(jì)算各計(jì)算單元內(nèi)的各流體組分體積分?jǐn)?shù)。兩相之間的相互作用只有表面張力，此處設(shè)置為72 mN/m。搖瓶的運(yùn)動(dòng)通過編譯自定義函數(shù)(UDF)動(dòng)態(tài)網(wǎng)格實(shí)現(xiàn)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為

ω=Acos (2πft)2πf$\omega =Acos\left(2\pi ft\right)2\pi f$(2)

其中，ω$\omega$為培養(yǎng)瓶繞旋轉(zhuǎn)軸的旋轉(zhuǎn)角速度，rad/s；A為振幅，rad，本研究使用的搖床A=0.03889 rad；f$f$為振蕩頻率，Hz；t為時(shí)間，s。運(yùn)動(dòng)原點(diǎn)位于距方瓶底部中心3 cm的位置，坐標(biāo)為（0，0，-0.03）；旋轉(zhuǎn)軸為+Y$+Y$軸，重力加速度指向?Z$-Z$方向（圖2）。為確定合適的湍流模型，首先對(duì)T25培養(yǎng)瓶的雷諾數(shù)進(jìn)行了分析。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)為明渠流（open-channel flow），特征長(zhǎng)度選用水力半徑Rh，其定義式為[17]

Rh=whw+2h$R_h=\frac{wh}{w+2h}$(3)

其中，w為液面寬度，m；h為液層深度，m；分母w+2h$w+2h$為濕周長(zhǎng)；相應(yīng)地，其雷諾數(shù)可表示為

Re=ρωmaxrRhμ$Re=\frac{\rho {\omega }_{max}r{R}_h}{\mu }$(4)

其中，ωmax${\omega }_{max}$為搖床運(yùn)動(dòng)的最大角速度，rad/s；r為T25方瓶?jī)?nèi)液面與搖床轉(zhuǎn)軸之間的距離。根據(jù)式（4），搖床轉(zhuǎn)速為10~30 r/min時(shí)，Re<500，位于層流區(qū)，無須湍流模型。轉(zhuǎn)速為60~80 r/min時(shí)，Re>1000，選取SST k-ω湍流模型，該模型在較低雷諾數(shù)時(shí)也有良好的表現(xiàn)[18-19]。對(duì)于過渡區(qū)（40~50 r/min）的準(zhǔn)確模擬較為困難，本文考察并比較了SST k-ω，Transition k-kl-ω和Transition SST模型。

在開始動(dòng)態(tài)網(wǎng)格模擬之前，首先設(shè)置ω=0$\omega =0$，在靜止?fàn)顟B(tài)下使表面張力作用達(dá)到平衡，然后啟用式（2），用動(dòng)態(tài)網(wǎng)格求解。求解過程中監(jiān)視體系內(nèi)平均液速隨時(shí)間的振蕩，直至達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)。之后，開啟組分傳輸模型并加入示蹤劑繼續(xù)以動(dòng)態(tài)網(wǎng)格求解。由于示蹤劑濃度極低，為了不影響體系性質(zhì)，其理化性質(zhì)假設(shè)與水完全相同，擴(kuò)散系數(shù)采用水的自擴(kuò)散系數(shù)2.9×10-9 m2/s。求解過程中監(jiān)視體系計(jì)算域內(nèi)多點(diǎn)示蹤劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化，直至混合均勻。

剪切應(yīng)力和能量耗散率是影響動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的重要參數(shù)，但是直接測(cè)量微型反應(yīng)器內(nèi)的剪切應(yīng)力和能量耗散率比較困難，而通過CFD模擬則比較容易獲得。剪切應(yīng)力和總的能量耗散率的表達(dá)式分別為

τ=ρk+μS$\tau =\rho k+\mu S$(5)P=∫(ρε+μS2)dV$P=\int (\rho \epsilon +\mu S^2)dV$(6)

其中，τ$\tau$為剪切應(yīng)力，Pa；ρ$\rho$為流體密度，kg/m3；μ為流體動(dòng)力黏度，Pa?s；k為湍流動(dòng)能，m2/s2；S為剪切應(yīng)變率，s-1。ρk$\rho k$為湍流剪切應(yīng)力，μS$\mu S$為黏性剪切應(yīng)力。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 傳質(zhì)系數(shù)

傳質(zhì)性能是細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的關(guān)鍵指標(biāo)，決定了氧氣的供給和CO2廢氣的排放。細(xì)胞生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間后，其進(jìn)一步生長(zhǎng)將受到培養(yǎng)環(huán)境中溶解氧的限制。培養(yǎng)所能達(dá)到的密度、細(xì)胞狀態(tài)以及生長(zhǎng)代謝情況都與培養(yǎng)體系中的溶氧濃度有著直接的關(guān)系，同時(shí)CO2的分壓還會(huì)影響培養(yǎng)體系的酸度。

體積傳質(zhì)系數(shù)kLa是液膜傳質(zhì)系數(shù)kL（m/s）與傳質(zhì)比表面積a（m2/m3）的乘積。靜止的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)kL僅受O2和CO2在液體中的擴(kuò)散系數(shù)影響，而a=1/h$a=1/h$，即其液層高度的倒數(shù)[7]。運(yùn)動(dòng)過程中，kL和a還受界面更新和能量耗散率的影響。運(yùn)動(dòng)不但使氣液界面發(fā)生形變，增大傳質(zhì)面積，還通過拉伸與壓縮氣液界面降低液膜傳質(zhì)阻力[20-21]。此外，T25培養(yǎng)瓶瓶蓋上的無菌過濾膜還可能產(chǎn)生額外的傳質(zhì)阻力，后者甚至可能成為限制氧傳遞的主要因素。為了研究其影響，使用注射器針頭刺穿過濾膜直接向瓶?jī)?nèi)注入空氣，并與帶過濾膜的培養(yǎng)瓶以及開口的培養(yǎng)瓶的傳質(zhì)速率進(jìn)行了比較。圖3展示了幾種典型的操作條件組合下溶氧從0達(dá)到飽和的過程曲線。結(jié)果表明，不同操作條件下的傳氧速率有明顯差別。30 r/min時(shí)由于直接向瓶?jī)?nèi)通入空氣，溶氧達(dá)到飽和的速率比40 r/min要高，說明瓶蓋處的空氣濾膜對(duì)氧傳遞有較大的負(fù)面影響。

圖3

圖3   不同振蕩轉(zhuǎn)速與換氣方式組合下T25培養(yǎng)瓶中溶氧變化

a—置換氮?dú)?開口無瓶蓋;b—置換氮?dú)?刺穿瓶蓋通空氣;c—置換氮?dú)?蓋瓶蓋,不通空氣;d—未置換氮?dú)?刺穿瓶蓋通空氣

Fig.3   Evolution of dissolved oxygen under different combinations of rocking speed and aeration method

為了對(duì)比不同的通氣方式下過濾膜對(duì)傳質(zhì)的影響，圖4進(jìn)一步對(duì)不同的操作條件組合下的kLa進(jìn)行了定量分析。需要指出，式（1）可以用來擬合任何一階響應(yīng)過程，即便溶氧響應(yīng)曲線是由瓶蓋上的過濾膜決定的，其響應(yīng)曲線仍然可能符合式（1）。因此，圖4中給出的kLa只能認(rèn)為是“表觀傳質(zhì)系數(shù)”，即綜合各因素表現(xiàn)出的傳質(zhì)系數(shù)。若非另有說明，本文討論的kLa均為表觀值。

圖4

圖4   振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)T25培養(yǎng)瓶表觀傳質(zhì)系數(shù)的影響

a—置換氮?dú)?開口無瓶蓋;b—置換氮?dú)?刺穿瓶蓋通空氣;c—置換氮?dú)?蓋瓶蓋,不通空氣;d—未置換氮?dú)?刺穿瓶蓋通空氣

Fig.4   Effect of rocking speed on the apparent mass transfer coefficient

從圖4中分析得到，在置換氮?dú)夂蟛煌諝鈼l件下，T25培養(yǎng)瓶低轉(zhuǎn)速下（< 60 r/min）開口（a）和蓋瓶蓋（d）的kLa并無明顯差別，說明傳質(zhì)阻力主要在氣液界面，而不是瓶口的過濾膜。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到60 r/min及以上時(shí)，開口（a）的kLa明顯大于蓋瓶蓋（d）。具體的，60 r/min以下時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)Re小于1000，處于層流區(qū)，因此液膜阻力對(duì)擴(kuò)散傳質(zhì)起主導(dǎo)作用，瓶蓋上的空氣濾膜的影響不明顯；60 r/min時(shí)開始向湍流區(qū)過渡，液膜傳質(zhì)阻力開始降低，空氣濾膜影響瓶?jī)?nèi)、外的氣體交換進(jìn)而影響瓶?jī)?nèi)氣相中的氧氣分壓和傳質(zhì)速率。通過刺穿空氣濾膜直接通氣的情況下，表觀傳質(zhì)系數(shù)在所有轉(zhuǎn)速下都高于不通氣的操作。在蓋瓶蓋且強(qiáng)制通氣條件下，T25培養(yǎng)瓶置換（b）與不置換（c）氮?dú)鉄o明顯差別，這是由于本實(shí)驗(yàn)中置換氮?dú)馑璧臅r(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于溶氧達(dá)到飽和所需的時(shí)間。

Nienow等[22]研究了一株工業(yè)CHO細(xì)胞在微型攪拌釜生物反應(yīng)器（賽多利斯ambrTM 15）內(nèi)表達(dá)IgG4時(shí)的傳質(zhì)性能。以水作反應(yīng)體系時(shí)，在裝液量為13 ml、轉(zhuǎn)速1500 r/min、氣速1.0 ml/min下達(dá)到較高的kLa=17.58 h-1。在T25培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)速達(dá)到60 r/min以上時(shí)，圖4中的四種條件全部達(dá)到或超過了該水平。在刺穿空氣濾膜直接通空氣時(shí)，80 r/min的kLa超過了ambrTM 15的兩倍。這主要是培養(yǎng)瓶的比表面積遠(yuǎn)大于ambrTM15微型攪拌釜，且振蕩的方式使氣液界面發(fā)生形變與攪拌相比能效更高。上述分析表明，振蕩的培養(yǎng)瓶更適合對(duì)剪切敏感且耗氧量大或密度較高的細(xì)胞培養(yǎng)。

綜上所述，隨著振蕩轉(zhuǎn)速提高，T25培養(yǎng)瓶的體積傳質(zhì)系數(shù)kLa提高。振蕩轉(zhuǎn)速高時(shí)，氣液界面變化快，交界面積大，流動(dòng)形態(tài)更不規(guī)則，更新速率加快，根據(jù)穿透理論，傳質(zhì)系數(shù)應(yīng)該更高。若剪切應(yīng)力在可以承受的范圍內(nèi)，可以選擇較高的振蕩轉(zhuǎn)速進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以支撐更高的細(xì)胞密度。也可在瓶蓋上整合一個(gè)連接潔凈氣體的微型接口，適當(dāng)通入氧氣或空氣，提高氣相中的氧分壓，促進(jìn)氧傳遞。

2.2 液相混合

混合特性是衡量生物反應(yīng)器性能的另一關(guān)鍵指標(biāo)。T25培養(yǎng)瓶體積較小，湍流程度也較低，混合時(shí)間不能忽視。尤其是進(jìn)行高密度培養(yǎng)時(shí)，混合可能會(huì)影響細(xì)胞微環(huán)境的均一性。本研究使用示蹤劑比色法研究T25培養(yǎng)瓶不同操作條件下的混合時(shí)間。典型的70 r/min培養(yǎng)瓶混合過程中原始視頻幀、處理后的紅色光吸收以及CFD模擬結(jié)果如圖5所示。與其對(duì)應(yīng)的混合過程吸光度標(biāo)準(zhǔn)差隨時(shí)間的變化如圖6所示?；旌蠒r(shí)間定義為標(biāo)準(zhǔn)差達(dá)到最終穩(wěn)態(tài)值的5%內(nèi)所需的時(shí)間。

圖5

圖5   70 r/min 時(shí)T25培養(yǎng)瓶混合情況及紅色光吸收情況與CFD模擬結(jié)果的比較

左—原始視頻幀;中—紅色光吸光度;右—CFD模擬結(jié)果

Fig.5   Red light absorbance after tracer addition under 70 r/min rocking compared with CFD simulation

圖6

圖6   70 r/min時(shí)T25培養(yǎng)瓶混合過程紅色光吸光度標(biāo)準(zhǔn)差

Fig.6   Evolution of the standard deviation of red light absorbance under 70 r/min rocking

由于翹板搖床上可以放置甚至堆疊多個(gè)T25培養(yǎng)瓶，不同位置的培養(yǎng)瓶的重心與搖床旋轉(zhuǎn)軸相對(duì)位置不同，有可能會(huì)影響傳質(zhì)與混合。圖7考察了培養(yǎng)瓶與旋轉(zhuǎn)軸相對(duì)位置對(duì)混合時(shí)間的影響。結(jié)果表明，在翹板搖床中央正放、左側(cè)正放以及中央墊高2.5 cm正放三個(gè)條件下，混合時(shí)間沒有明顯差別，即培養(yǎng)瓶距離旋轉(zhuǎn)中心的水平和垂直距離對(duì)混合時(shí)間的影響不明顯。這說明影響流體力學(xué)性質(zhì)的是角向加速度（各處相同）而不是線速度（各處不同），符合慣性系統(tǒng)預(yù)期。在培養(yǎng)瓶中心軸與擺動(dòng)轉(zhuǎn)軸成45°放置條件下，培養(yǎng)瓶的瓶壁起到了擋板的作用，混合時(shí)間明顯小于其他三個(gè)條件。在培養(yǎng)瓶中加入覆蓋培養(yǎng)瓶底部約2/3區(qū)域直徑為2 mm的玻璃珠，不同轉(zhuǎn)速下的混合情況如圖8所示。與常規(guī)操作相比，加入玻璃珠混合時(shí)間大大縮短。由圖7、圖8分析可得，無論培養(yǎng)瓶與旋轉(zhuǎn)軸相對(duì)位置如何，有無加入玻璃珠，當(dāng)振蕩頻率從30 r/min增加到70 r/min時(shí)，混合時(shí)間都有明顯縮短，從10 min以上降低到1 min以下量級(jí)。

圖7

圖7   振蕩轉(zhuǎn)速和旋轉(zhuǎn)軸位置對(duì)T25培養(yǎng)瓶混合情況的影響

a—正放;b—培養(yǎng)瓶中心軸與擺動(dòng)轉(zhuǎn)軸成45°;c—墊高;d—偏左

Fig.7   Effect of rocking speed and axial position on the mixing time

圖8

圖8   玻璃珠對(duì)T25培養(yǎng)瓶混合時(shí)間的影響

a—中央正放不加玻璃珠;b—中央正放加玻璃珠

Fig.8   Effect of glass beads on the mixing time

以上分析表明，在翹板搖床上放置多個(gè)培養(yǎng)瓶時(shí)，不同位置上的培養(yǎng)條件應(yīng)該十分接近，可以用于培養(yǎng)基的優(yōu)化等對(duì)平行性要求較高的實(shí)驗(yàn)。在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下，在培養(yǎng)瓶中加入不發(fā)生反應(yīng)且對(duì)細(xì)胞無害的固形物以及設(shè)置擋板等有利于反應(yīng)器內(nèi)的混合與傳質(zhì)，同時(shí)也會(huì)增加剪切應(yīng)力，或可模擬大規(guī)模生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的高剪切環(huán)境。

2.3 CFD數(shù)值模擬

2.3.1 網(wǎng)格無關(guān)性驗(yàn)證

首先通過考察網(wǎng)格數(shù)量對(duì)計(jì)算域內(nèi)的平均液速的影響進(jìn)行網(wǎng)格無關(guān)性分析。以速度大小改變量不超過3%確定最佳網(wǎng)格數(shù)量。在80 r/min下使用SST k-ω模型在不同網(wǎng)格數(shù)量下計(jì)算域內(nèi)平均液速隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖9所示。最終確定模型的網(wǎng)格單元數(shù)為344×103。

圖9

圖9   80 r/min下不同網(wǎng)格數(shù)量下計(jì)算域內(nèi)平均液速隨時(shí)間變化曲線

Fig.9   Grid-independence test by monitoring mass-average liquid velocity magnitude at 80 r/min

2.3.2 過渡區(qū)模型的選擇

T25培養(yǎng)瓶在40 r/min和50 r/min時(shí)，Re分別是637和797，處于過渡區(qū)[17]。對(duì)層流-湍流過渡區(qū)的準(zhǔn)確模擬，尤其是使用通用的CFD方法進(jìn)行并行計(jì)算求解是非常困難的[8, 23]。以40 r/min為例，本文考察幾種常用的過渡區(qū)模型，并通過與20 r/min的Laminar模型與60 r/min的SST k-ω模型進(jìn)行比較，以便選擇較合適的模型進(jìn)行進(jìn)一步分析。從圖10可以看到，四種過渡區(qū)模型給出的40 r/min時(shí)液速值均處于20 r/min與60 r/min對(duì)應(yīng)值之間，符合預(yù)期。但對(duì)于剪切應(yīng)力而言，40 r/min只有層流模型的剪切應(yīng)力在20 r/min與60 r/min之間，Transition k-kl-ω模型明顯高于60 r/min，其余兩模型低于20 r/min；對(duì)于能量耗散率而言，40 r/min的Laminar模型同樣在20 r/min與60 r/min之間，符合實(shí)際情況。綜合分析，40 r/min過渡區(qū)的情況用通用的湍流模型可能無法準(zhǔn)確模擬，后續(xù)討論中用Laminar層流模型近似求解。

圖10

圖10   不同模型與轉(zhuǎn)速的CFD模擬結(jié)果

Fig.10   CFD simulation results by different turbulent models under different rocking speeds

2.3.3 混合時(shí)間

在計(jì)算流體力學(xué)模型求解達(dá)到擬穩(wěn)態(tài)后（即平均液速呈現(xiàn)有規(guī)律的周期性變化時(shí)），在X=0 m，Y=0.005 m，Z=0.003 m處添加0.05 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.001的液相示蹤劑并啟用組分傳輸方程，繼續(xù)采用瞬時(shí)法模擬示蹤劑在計(jì)算域內(nèi)的混合過程。求解過程中，在計(jì)算域內(nèi)的不同位置選擇多個(gè)點(diǎn)監(jiān)測(cè)示蹤劑的濃度變化?；旌蠒r(shí)間定義為所有監(jiān)測(cè)點(diǎn)的示蹤劑濃度落入最終穩(wěn)態(tài)值的5%內(nèi)所需的時(shí)間?；旌暇鶆蚝螅M結(jié)束。

圖11給出了70 r/min時(shí)T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)處（圖11插圖）示蹤劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化（五條彩色曲線）以及實(shí)驗(yàn)測(cè)定混合過程紅色光吸光度標(biāo)準(zhǔn)差變化（原始信號(hào)與FFT濾波后信號(hào)）。插圖中，中央黑色圓點(diǎn)為示蹤劑加樣位置，其余灰色點(diǎn)為選定監(jiān)測(cè)點(diǎn)位置。距離示蹤劑添加位置較近的監(jiān)測(cè)點(diǎn)，初始示蹤劑濃度高；反之則初始濃度幾乎為零。前者逐漸降低，后者逐漸增加，直至趨于平衡。FFT濾波后的紅色吸收光標(biāo)準(zhǔn)差變化也逐漸平衡。CFD模擬的混合時(shí)間與實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的吻合程度較高，證明相應(yīng)的模擬方法可以用于混合時(shí)間的分析研究，也驗(yàn)證了模型的有效性。

圖11

圖11   混合過程中培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)不同位置示蹤劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與紅色吸收光標(biāo)準(zhǔn)差

Fig.11   Evolution of tracer mass fraction at five different points in the T-flask during mixing and the standard deviation of red light absorbance

2.3.4 氣液界面形狀及面積

本研究所用的細(xì)胞培養(yǎng)瓶屬于振蕩型微型反應(yīng)器。這類反應(yīng)器由于不存在分散于液相的氣泡，傳質(zhì)面積完全取決于液面面積。一般說來，氣液界面的形狀受振蕩產(chǎn)生的離心力和液體的表面張力決定。具體的，表面張力越高，靜止時(shí)界面面積越小，發(fā)生形變需要的臨界轉(zhuǎn)速越高；超過臨界轉(zhuǎn)速后，轉(zhuǎn)速越高，界面形變也越大。Hermann等[24]研究了96孔板在不同振蕩頻率下的液面形狀，發(fā)現(xiàn)當(dāng)振蕩半徑為25 mm時(shí)，振蕩頻率達(dá)到200 r/min才能觀察到肉眼可見的液面形變。Kensy等[25]在48孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，也有高轉(zhuǎn)速比低轉(zhuǎn)速液面形變明顯的結(jié)果。T25培養(yǎng)瓶較孔板而言，氣液交界面較大，應(yīng)在較低轉(zhuǎn)速下即可發(fā)生較大形變。

圖12（a）是本研究中T25培養(yǎng)瓶瓶體在翹板搖床不同轉(zhuǎn)速下達(dá)到流體力學(xué)擬穩(wěn)態(tài)后再回到水平位置時(shí)，在Y=0.5 cm截面氣液兩相的相對(duì)狀態(tài)，圖12（b）是實(shí)驗(yàn)過程中氣液界面形狀的照片。結(jié)果表明，CFD模擬結(jié)果與攝像頭捕獲結(jié)果相似，在10~50 r/min時(shí)氣液界面上的形態(tài)沒有明顯差別，皆幾乎與水平面平行。而在60~80 r/min時(shí)系統(tǒng)開始進(jìn)入湍流狀態(tài)，瓶?jī)?nèi)液體的相對(duì)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生明顯變化，氣液界面出現(xiàn)明顯擾動(dòng)，面積增大。圖13是CFD模擬培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)速度大小分布云圖，圖14為不同轉(zhuǎn)速下的氣液界面面積隨振蕩時(shí)間變化的CFD模擬結(jié)果。隨著轉(zhuǎn)速提高，氣液界面的面積增大，流動(dòng)形態(tài)更不規(guī)則，液面更新速率加快，這解釋了傳質(zhì)系數(shù)隨振蕩頻率增加的現(xiàn)象（圖4）。

圖12

圖12   T25培養(yǎng)瓶在20~80 r/min轉(zhuǎn)速下氣液界面狀態(tài)

Fig.12   Shape of the gas-liquid interface under 20—80 r/min rocking

圖13

圖13   不同轉(zhuǎn)速下T25培養(yǎng)瓶速度分布云圖

Fig.13   Contours of velocity magnitude in T25 flasks under different rocking speeds

圖14

圖14   不同轉(zhuǎn)速下氣液界面面積隨時(shí)間的變化

Fig.14   Variation of the gas-liquid interfacial area under different rocking speeds

2.3.5 剪切應(yīng)力

剪切是動(dòng)態(tài)反應(yīng)器中細(xì)胞損傷的主要原因之一，當(dāng)剪切作用超出細(xì)胞膜形變極限時(shí)，細(xì)胞膜破裂細(xì)胞死亡。在使用微載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，即便剪切應(yīng)力不至于直接造成細(xì)胞死亡，也可能將細(xì)胞從微載體上剝離。本研究中，振蕩轉(zhuǎn)速低于40 r/min時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)為層流，剪切主要為黏性剪切，轉(zhuǎn)速高于60 r/min時(shí)，流動(dòng)開始進(jìn)入湍流區(qū)，此時(shí)總的剪切應(yīng)力需加上湍流的作用，通過式（5）計(jì)算總的剪切應(yīng)力。若要較為準(zhǔn)確地模擬湍流剪切應(yīng)力應(yīng)使用雷諾應(yīng)力模型（RSM），由于本研究涉及的60、80 r/min雷諾數(shù)較低，k?ω$k-\omega$模型可以滿足此處討論之需要。20 r/min處于層流區(qū)，使用Laminar模型，40 r/min處于過渡區(qū)，通過前文比較研究選擇Laminar模型近似模擬。根據(jù)式（5）計(jì)算的不同轉(zhuǎn)速下一個(gè)振蕩周期內(nèi)的平均剪切應(yīng)力如圖15所示。結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)速的增高，平均剪切應(yīng)力的強(qiáng)度成指數(shù)增加趨勢(shì)。Ghasemian等[26]研究用于干細(xì)胞培養(yǎng)的125 ml轉(zhuǎn)瓶（裝液量50 ml）和150 ml滾瓶的流體動(dòng)力學(xué)特征時(shí)，得出常用操作條件下二者的平均剪切應(yīng)力范圍為0.015~0.046 Pa和0.019~0.044 Pa，范圍比本研究所用的方瓶要窄。搖床往復(fù)運(yùn)動(dòng)改變方向時(shí)瓶壁起擋板作用，以及搖床帶動(dòng)整個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)全部液體同時(shí)運(yùn)動(dòng)相比轉(zhuǎn)瓶和滾瓶能提供更高的能量輸入，使得剪切應(yīng)力增大。當(dāng)用于培養(yǎng)工藝研究時(shí)，振蕩的T25培養(yǎng)瓶能更接近大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)的情況。

圖15

圖15   轉(zhuǎn)速對(duì)質(zhì)量加權(quán)平均剪切應(yīng)力影響

Fig.15   Effect of rocking speed on the spatio-temporal mass-average shear stress

剪切應(yīng)力的平均值并不能完全代表它對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的可能影響，還要考慮培養(yǎng)瓶流場(chǎng)中是否存在局部應(yīng)力高于細(xì)胞承受能力的區(qū)域。20、40、60、80 r/min轉(zhuǎn)速下剪切應(yīng)力的分布情況如圖16所示。結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)速下的高剪切應(yīng)力都集中分布在培養(yǎng)瓶瓶壁尤其底面和氣液交界面的位置，液層中中間區(qū)域的剪切應(yīng)力明顯小于各個(gè)接觸面。80 r/min時(shí)平均剪切應(yīng)力<200 mPa，而接近瓶底處將近700 mPa，這是較低雷諾數(shù)下以黏性剪切為主時(shí)，無滑動(dòng)邊界條件的必然結(jié)果。振蕩的T25培養(yǎng)瓶在較小的體積下能更接近大型反應(yīng)器，適合用于高通量縮小模型研究。Li等[27]研究口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)中4000 L細(xì)胞培養(yǎng)過程的縮小模型時(shí)，模擬了14、800和4000 L生物反應(yīng)器葉輪轉(zhuǎn)速分別為66、48和44 r/min時(shí)的剪切應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)最大剪切應(yīng)力在10~100 mPa之間，與T25培養(yǎng)瓶中40 r/min以及60 r/min的模擬結(jié)果較為相似。

圖16

圖16   不同轉(zhuǎn)速下T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)剪切應(yīng)力分布云圖

Fig.16   Contours of shear stress in a T25 culture flask under different rocking speeds

2.3.6 能量耗散

對(duì)于細(xì)胞生物反應(yīng)器，能量耗散率ε是決定傳質(zhì)、混合和剪切特性的重要因素。ε的宏觀表現(xiàn)是比功率輸入，俗稱P/V（W/m3），其中P（W）是輸入總功率，V（m3）是反應(yīng)器中液體體積。對(duì)于傳統(tǒng)的攪拌釜反應(yīng)器，P可以通過轉(zhuǎn)矩測(cè)量較為準(zhǔn)確地獲得，也有比較可靠的經(jīng)驗(yàn)、半經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行估算[28-29]。對(duì)于微型反應(yīng)器，包括本研究中所使用的T25方瓶，實(shí)驗(yàn)測(cè)量功率輸入比較困難，但可以通過式（6）計(jì)算得到。不同轉(zhuǎn)速下一個(gè)振蕩周期內(nèi)的平均能量耗散率如圖17所示。與攪拌釜反應(yīng)器類似，能量耗散率隨轉(zhuǎn)速的提高呈指數(shù)上升趨勢(shì)[30]。80 r/min時(shí)的能量耗散率與其他三個(gè)轉(zhuǎn)速有明顯的區(qū)別，20、40、60 r/min時(shí)的能量耗散率都在較低范圍內(nèi)小幅度波動(dòng)，而80 r/min時(shí)，能量耗散率波動(dòng)幅度劇烈增大，整體的能量耗散率變高，在時(shí)間和空間上極不均勻。圖18為在幾個(gè)不同轉(zhuǎn)速下能量耗散率的分布情況，與圖15對(duì)照可以看出速度高的位置能量耗散率則越高，靠近液面處速度快速降低，能量耗散率也有一定下降。

圖17

圖17   轉(zhuǎn)速對(duì)質(zhì)量加權(quán)平均能量耗散率影響

Fig.17   Effect of speeds on the mass average ε

圖18

圖18   T25培養(yǎng)瓶能量耗散率分布云圖

Fig.18   Contours of the ε distribution in T25 flasks

Nienow等[22]在對(duì)ambr? 15微型攪拌釜反應(yīng)器的CFD模擬中發(fā)現(xiàn)在1500 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下，ambr? 15內(nèi)的液體流動(dòng)和能量耗散集中在攪拌槳周圍較小的區(qū)域內(nèi)，靠近液面處液體流動(dòng)速度同樣迅速下降。李雪良等[8]對(duì)ambr? 15及ambr? 250進(jìn)行了更加詳細(xì)的CFD模擬，結(jié)合實(shí)驗(yàn)認(rèn)為模擬的結(jié)果可以用于指導(dǎo)反應(yīng)器放大，但同時(shí)也指出由于ambr? 15內(nèi)的流動(dòng)處于從層流到湍流的過渡區(qū)，使用湍流模型進(jìn)行CFD模擬會(huì)有較大誤差。

3 結(jié) 論

通過對(duì)置于翹板搖床上的T25培養(yǎng)瓶在不同操作條件下的流體動(dòng)力學(xué)和混合傳質(zhì)特性進(jìn)行系統(tǒng)性分析，得出以下結(jié)論。

(1) 振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)傳質(zhì)系數(shù)具有決定性作用，換氣方式對(duì)傳質(zhì)速率也有一定影響。T25培養(yǎng)瓶綜合傳質(zhì)系數(shù)可達(dá)20~30 h-1，高于相同體積的微型攪拌釜反應(yīng)器。

(2) 振蕩轉(zhuǎn)速對(duì)混合時(shí)間具有巨大影響，從30~80 r/min，混合時(shí)間由數(shù)十分鐘降低至1 min以下，在培養(yǎng)瓶中加入擋板和玻璃珠可明顯促進(jìn)混合。

(3) VOF模型結(jié)合動(dòng)態(tài)網(wǎng)格可以對(duì)搖瓶?jī)?nèi)的多相流運(yùn)動(dòng)及混合情況較好模擬，用以獲得較難通過實(shí)驗(yàn)直接測(cè)量的性能參數(shù)。

(4) 高轉(zhuǎn)速下，T25培養(yǎng)瓶中剪切應(yīng)力和能量耗散率在時(shí)間與空間上分布極不均勻。瓶壁與氣液交界面處局部剪切應(yīng)力較高，但與市售微型攪拌釜反應(yīng)器接近。

振蕩的T25方瓶最有價(jià)值的應(yīng)用可能還包括微載體懸浮培養(yǎng)，這有待進(jìn)一步研究。

符 號(hào) 說 明