基于四象限液晶器件的差分相襯成像系統(tǒng)

在顯微成像領(lǐng)域中，由于無色生物樣本的振幅吸收率低，常規(guī)顯微鏡觀測下，成像對比度很低，傳統(tǒng)方法多采用對其染色的方法使其在顯微鏡下被觀測。然而對于生物樣本，化學(xué)染色方式使得生物樣本失活，對生物樣本進行熒光染色時，所采用的激光照明的方式又會不可避免地產(chǎn)生光毒性［1］，對生物樣本有損傷，難以對活體細胞進行長時間的觀測。因此，無標記的相位成像方法成為了生物觀測中逐漸采用的方式，并在近年來蓬勃發(fā)展［2-3］。相襯顯微鏡和微分干涉顯微鏡［4］的出現(xiàn)為人們觀測細胞提供了新的方式。根據(jù)光的干涉以及衍射將樣品的折射率信息即相位差轉(zhuǎn)換為振幅差，實現(xiàn)了無需標記的無色透明樣品觀測。為了更進一步提升成像性能，1984年Hamilton首次提出了差分相襯成像方法［5］，通過將分離式探測器與掃描式顯微成像系統(tǒng)相結(jié)合，實現(xiàn)了對樣品三維信息的定性觀察。2014年Guo等人提出使用液晶顯示器件作為空間光調(diào)制器［6］，實現(xiàn)了顯微鏡的多模態(tài)成像功能。2015年，Tian等［7］通過將LED陣列作為照明調(diào)控模塊，提出了定量的差分相襯成像方法。同年Zuo等人［8］通過對現(xiàn)有倒置顯微鏡進行優(yōu)化，在顯微成像系統(tǒng)中外接一個4F系統(tǒng)，在4F系統(tǒng)中兩透鏡的共焦平面放置一款商用LCD顯示屏進行調(diào)控，實現(xiàn)了差分相襯成像等多種成像模式。然而在實際場景下，商用LCD的顯示器尺寸大，對于一般的顯微鏡成像系統(tǒng)，聚光鏡后焦面位于機械可調(diào)光闌處，難以將商用LCD器件放在聚光鏡后焦面處。并且商用LCD因其結(jié)構(gòu)存在黑矩陣遮光膜，導(dǎo)致其對光的透過率低，其彩色濾光膜也會進一步影響透過率。對于差分相襯成像系統(tǒng)來說，這幾種因素會影響系統(tǒng)成像性能的進一步提升。

為了實現(xiàn)活體細胞觀測系統(tǒng)的小型化、集成化、高對比度、低成本需求，貼近差分相襯成像的應(yīng)用場景，本文提出了一種可調(diào)控的顯微鏡聚光鏡模塊，目前在商用顯微鏡OLYMPUS CX23上進行優(yōu)化改裝，所設(shè)計使用的四象限液晶器件尺寸僅為22 mm×18 mm，可嵌入于顯微鏡聚光透鏡的前焦平面處。

2 成像模型與理論

2.1　成像系統(tǒng)的構(gòu)成

圖1為基于四象限液晶器件的差分相襯成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖。它由相機、成像透鏡、物鏡、載物平面、聚光鏡、四象限液晶器件以及光源組成。系統(tǒng)由一款商用顯微鏡OLYMPUS CX23改裝而成，將小型的四象限液晶器件嵌入放置在聚光透鏡的前焦平面處。

圖1  液晶差分相襯成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

Fig.1  Structure diagram of liquid crystal differential phase contrast imaging system

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2.2　定量差分相襯成像算法原理

定義薄樣品為一個純相位物體：

o(r)=ei?(r)

 ， （1）

其中：r=(x,y)為樣品平面的空間坐標，?(r)為樣品的相位。采用弱相位近似下［9-10］，

o(r)≈1+i?(r)

 . （2）

在某一角度的照明下，樣品平面上的復(fù)函數(shù)為照明函數(shù)Sj(r)與樣品的透過率函數(shù)o(r)的乘積，其中j代表某個方向的照明，系統(tǒng)的光瞳函數(shù)P(u)由顯微物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定，P(u)=NA/λ。當(dāng)系統(tǒng)的光瞳函數(shù)P(u)已知時，相機上采集到的強度譜為：

I(uj)=S(uj)δ(u)|P(uj)|2+iS(uj)?(u)×[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)] .

（3）

為了線性化地恢復(fù)樣品的相位信息，忽略計算過程中的二次交叉項［11］。在正常照明情況下，照射到樣品平面上的光源是空間部分相干光，那么強度譜I(u)為多個角度照明下采集到的強度譜的和：

I(u)=Bδ(u)+iΦ(u)PTF(u)

 ， （4）

式中B代表背景項：

B=?S(uj)|P(uj)|2d2uj

 . （5）

系統(tǒng)的相位傳遞函數(shù)PTF為：

PTF(u)=?S(uj)[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)]d2uj

 . （6）

我們使用兩個正交軸上的4張非對稱照明下采集到的圖像，計算樣本的相位對比圖像［5，12］：

IDPClr=Il?IrIl+Ir

 . （7）

Il和Ir代表左半圓和右半圓照明時采集到的圖像，IDPClr為樣品在上下方向上的相位對比圖，此時相位傳遞函數(shù)為：

F(Il?Ir)=iΦ(u)[PTFl(u)?PTFr(u)]

    ， （8）

F(Il+Ir)=(Bl+Br)δ(u)

 . （9）

對式（7）傅里葉變換，結(jié)合式（8）、（9）得到差分情況下其強度譜為：

IDPClr(u)=iΦ(u)PTFlr(u)Bl+Br

 . （10）

更新后差分情況下的相位傳遞函數(shù)整合為：

PTFDPClr(u)=?Slr(uj)[P*(uj)P(u+uj)?P(uj)P*(u?uj)]d2uj?Slr(uj)|P(uj)|2d2uj

. （11）

這里的Slr(uj)是左半圓照明減去右半圓照明后的照明強度分布。最后通過反卷積和Tikhonov正則化，解算出樣品的定量相位［10］：

?(r)=F?1?????????∑k[PTFDPC*k(u)?   IDPCk(u)]∑k∣∣PTFDPCk(u)∣∣2+α?????????

     . （12）

式中：PTFDPC*k(u)為相位傳遞函數(shù)在不同軸向上的共軛，k代表水平方向或者豎直方向的軸向，α為穩(wěn)定卷積和防止噪聲放大的正則化參數(shù)。

2.3　液晶器件的設(shè)計

圖2（a）給出了四象限液晶器件的實物圖，中間小型的為所制作的液晶器件，通過外側(cè)轉(zhuǎn)接件固定到聚光鏡上，紅框中器件顯示的是兩個象限通光，兩個象限不通光的效果。圖2（b）所示為所制作的液晶器件被均分為４個象限。四象限液晶器件在本文搭建的系統(tǒng)中相當(dāng)于一個開關(guān)作用，每一次獲取圖像時僅有半圓形狀的兩個象限通光如圖2（c）所示。

圖2  本研究使用的液晶器件

Fig.2  Liquid crystal devices used in this study

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根據(jù)差分相襯成像的照明調(diào)制需求，研究扭曲液晶器件的透過率特性以及響應(yīng)速度特性，設(shè)計并制作扭曲液晶器件。扭曲液晶器件的透過率T與器件的調(diào)制量u的關(guān)系式如式（13）所示［13］：

T=1?sin2[θ1+u2?????√]1+u2

 ， （13）

式中：T為液晶器件的透過率，θ為扭曲角度， u=2Δnd/λ，Δn為液晶的折射率各向異性，d為液晶器件的液晶層厚度，λ為照明光波長，對于本文使用的TN型液晶器件，θ=90°。透過率曲線如圖3所示，定義第一個使得透過率T為1時的調(diào)制量為第一極值點，m代表第幾極值點，m與調(diào)制量u的關(guān)系式如式（14）所示：

u=4m2?1???????√

， （14）

圖3  液晶器件透過率與調(diào)制量關(guān)系圖

Fig.3  Relationship between transmissivity and modulation of liquid crystal device

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液晶器件的響應(yīng)時間定義為加電時和斷電時透光率變化10%所需要的時間，前者為上升時間，后者為下降時間，分別用τon和τoff來表示［13］：

τon=η?   d2ΔεV2?π2k

， （15）

τoff=η?   d2π2k

， （16）

式中：η為黏度，k為彈性系數(shù)，d為液晶器件厚度，Δε為介電各向異性，V為外加電壓。響應(yīng)時間主要與液晶器件的厚度有關(guān)，結(jié)合器件的透過率特性進行參數(shù)設(shè)計，本文設(shè)計的扭曲液晶器件根據(jù)透過率為1時的第一極值點進行設(shè)計，即m=1。當(dāng)采用第二或者第三極值點時，所需要的調(diào)制量u也增大，液晶盒厚d增加，使液晶器件的響應(yīng)時間變長。在照明光波長為550 nm的情況下，計算得到液晶器件的Δn為0.11，器件厚度為4 μm。

圖4為實驗測得的相對光透過率和時間的曲線，經(jīng)計算得到實測的器件的總響應(yīng)時間為21 ms。測量器件亮態(tài)和暗態(tài)的消光比達到350∶1。

圖4  實驗測得相對透過率與時間曲線

Fig.4  Relative transmittance versus time curve measured experimentally

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液晶器件嵌入顯微鏡聚光鏡模塊的前焦平面處，由于聚光鏡模塊的空間限制，前焦平面的空余區(qū)域為直徑為30 mm的圓形區(qū)域，液晶器件通過轉(zhuǎn)接嵌入聚光鏡前焦平面鏡處，因此液晶器件的尺寸定為22 mm×18 mm，其中通光區(qū)域的大小為16 mm×16 mm，可以提供匹配40x物鏡的照明NA。

3 實驗結(jié)果與分析

實驗系統(tǒng)搭建在商用顯微鏡OLYMPUS CX23上，將設(shè)計制作的小型扭曲液晶器件通過轉(zhuǎn)接件安置于顯微鏡聚光透鏡的后焦面處。

3.1　微凸透鏡陣列成像實驗

為了驗證所搭建系統(tǒng)的成像性能，我們對微凸透鏡陣列進行成像實驗。物鏡放大倍率為20×，0.4 NA。使用微透鏡陣列的參數(shù)為單個截面尺寸為288 μm，曲率半徑為9 764 μm，根據(jù)幾何關(guān)系計算出微透鏡陣列的厚度約為1 061 μm。空氣介質(zhì)的折射率參數(shù)nd=1，微透鏡陣列的折射率為nm=1.46。

對微凸透鏡陣列進行定量相位重建實驗，解算獲得的定量相位圖像如圖5所示。

圖5  解算出的微透鏡陣列相位圖

Fig.5  Calculated phase diagram of microlens array

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為了量化相位重建的效果，我們繪制了單個微透鏡某一方向上的相位變化曲線并與理論曲線進行對比，如圖6所示。

圖6  理論曲線與實驗測得曲線對比

Fig.6  Comparison between theoretical curve and experimental curve

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理論計算經(jīng)過微透鏡陣列的相位差為［14］：

Δ?=2πd(nm?nd)λ

. （17）

理論計算經(jīng)過微透鏡陣列的最大相位差為5.71 rad，實驗測得為5.60 rad，與理論值差2%，結(jié)果展現(xiàn)了98%的準確率。

皮爾遜相關(guān)系數(shù)是衡量曲線相似度的一種方式，輸出范圍為-1~+1，其中0代表無相關(guān)性，負值代表負相關(guān)，正值代表正相關(guān)。

Pearson相關(guān)系數(shù)計算方式如式（18）所示：

ρ(A,B)=1N?1∑i=1N(Ai?μAσA)(Bi?μBσB)

 . （18）

我們對實驗解得的微透鏡陣列的相位圖像中單個微透鏡的某一方向上的相位差值曲線與理論曲線進行相關(guān)性計算，得到相關(guān)系數(shù)為0.994 7，結(jié)果表明了系統(tǒng)定量相位成像的高精確度。

3.2　胚胎干細胞成像實驗

驗證了系統(tǒng)的定量相位成像能力后，我們對胚胎干細胞進行了定量相位重建實驗，成像效果如圖7所示。在普通明場顯微鏡情況下，未染色的生物細胞的光學(xué)吸收系數(shù)低，我們難以觀測到胚胎干細胞的有效信息，但在相位圖像中，可以清楚看到胚胎干細胞的細胞結(jié)構(gòu)以及其中的線粒體等微觀結(jié)構(gòu)。

圖7  胚胎干細胞明場圖像和重建相位圖像

Fig.7  Embryonic stem cell bright field image and reconstruction phase image

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4 結(jié)論

本文提出了一種可調(diào)控的顯微鏡聚光鏡模塊，根據(jù)差分相襯成像的照明調(diào)制需求設(shè)計了聚光鏡模塊中的小型液晶器件進行調(diào)控，所設(shè)計的器件尺寸為22 mm×18 mm，對比度達到350∶1，響應(yīng)速度為21 ms。通過微凸透鏡陣列的實驗驗證了根據(jù)該模塊搭建的系統(tǒng)的定量相位成像性能，胚胎干細胞成像效果進一步體現(xiàn)了本文在實際場景中的應(yīng)用效果。本文所設(shè)計的液晶器件只是初步的應(yīng)用嘗試，未來可以通過選擇其他參數(shù)液晶材料進行設(shè)計，如快速響應(yīng)液晶，制作出對比度更高，響應(yīng)速度更快的液晶器件，為未來實現(xiàn)高成像速度的實時活體成像系統(tǒng)打下良好的基礎(chǔ)。