大腸埃希菌臨床菌株生物被膜形成的分析-醫(yī)學臨床論文

Quantificative analysis for Biofilm-Formation of Escherichia coli Isolates

ABSTRACT: Objective Escherichia coli clinical isolateswere analyzed quantitatively for their biofilm-formation. Methods A method of microtiterplate culture-crystal violet stain was established for the quantificative analysis of biofilm-formation for the isolates. And 49 Escherichia coli isolates were testeded by the method for their biofilm-formation. Results Among 49 Escherichia coli isolates examined, 18 formed biofilm of middle quantity, 24 more quantity biofilm, 7 small quantity. Conclusion Most of Escherichia coli clinical isolates formed biofilm of middle and more-quantity.

KEY WORDS: Escherichia coli；bacterial biofilm；quantificative analysis

摘要：許多病原性細菌在感染機體內可以生物被膜狀態(tài)存在，生物被膜的形成是某些細菌性疾病難以治愈或反復發(fā)作的主要原因之一[4,5]。大腸埃希菌（Escherichia coli）是醫(yī)院常見條件致病菌之一，是典型的生物被膜菌[1-5]。本研究通過建立大腸埃希菌生物被膜的檢測方法，分析大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成。

關鍵詞：大腸埃希菌；細菌生物被膜；定量分析

中圖分類號：R387.99  文獻標識碼：A

材料和方法

一、試驗菌株 

49株大腸埃希菌，分離自2008年1月至2月間江西省九江市第一人民醫(yī)院患者的各類標本（痰液、尿液、創(chuàng)口分泌物、血液），經美國BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)，生物被膜陽性銅綠假單胞菌PAO1。

二、大腸埃希菌生物被膜檢測方法的建立

    參考文獻方法[6]建立大腸埃希菌生物被膜檢測方法。對在49株大腸埃希菌臨床菌株中隨機選取的6株菌、生物被膜陽性銅綠假單胞菌PAO1進行生物被膜培養(yǎng)。將上述7株菌在Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，用細菌標準比濁管調節(jié)菌液濃度為1×109CFU/mL；用96孔平底組織培養(yǎng)板培養(yǎng)生物被膜，每孔加入10μL菌液和200μL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)液（1:50稀釋），空白對照孔只加培養(yǎng)液，每株菌作6個復孔，37℃靜止培養(yǎng)。選取72h生物被膜培養(yǎng)物進行定量分析。每個菌取3個復孔，加入150μL 0.25g/L結晶紫染液，室溫下染色15min；用生理鹽水沖洗后晾干；每孔加入95％乙醇150μL，室溫脫色10min；用紫外可見分光光度計檢測每孔脫色液在570nm光波的吸光度(A570nm)。每個菌的A570nm等于其3個復孔的A570nm平均值減去3個空白對照孔A570nm的平均值。同時，對每個菌的另3個復孔進行細菌計數，即每孔加入150μL 0.25g/L結晶紫染液，室溫下染色15min；再用自制的細胞刮刀刮取培養(yǎng)孔底部及側壁的生物被膜，收集被膜菌液，在漩渦振蕩器上將菌體充分打散；最后用血球計數板計數染色菌體的數量；每個培養(yǎng)孔生物被膜中細菌的數量取3個復孔的平均值。

應用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對各大腸埃希菌生物被膜結晶紫染色的乙醇脫色液A570nm值與其相應生物被膜中細菌的數量進行相關性分析，以判斷能否以乙醇脫色液A570nm值輔助衡量比較生物被膜中細菌的數量。生物被膜中細菌的數量越多，則表明生物被膜形成的量越多。

三、大腸埃希菌臨床菌株生物被膜形成的半定量分析

  按上述方法，檢測48株大腸埃希菌臨床分離株生物被膜的形成，即生物被膜培養(yǎng)物乙醇脫色液的A570nm。生物被膜陽性菌銅綠假單胞菌PAO1可形成中等厚度、或量的生物被膜，本試驗中該菌的A570nm為0.456，同時參照文獻方法[6，7]，將所測各菌株生物被膜形成的量分為三個等級：A570nm ≤ 0.3 者為生物被膜形成的量少，以“＋”表示；0.3 ＜A570nm  ≤ 1.0者為生物被膜形成的量中等，以“＋＋”表示；1.0 ＜A570nm者為生物被膜形成的較大，以“＋＋＋”表示。按上述標準對各菌株生物被膜形成的量進行比較分析。

結  果

一、大腸埃希菌生物被膜形成的定量分析方法的建立 

隨機選取的6株大腸埃希菌臨床分離株和生物被膜陽性對照菌進行生物被膜培養(yǎng)，分別得到生物被膜結晶紫染液之乙醇脫色液A570nm，以及生物被膜中細菌的數量。經SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，生物被膜中細菌數的對數與其A570nm成正相關（r＝0.945）(見圖1)。結果表明以大腸埃希菌生物被膜結晶紫染液的乙醇脫色液A570nm 可衡量比較生物被膜中細菌的相對數量。

圖1 大腸埃希菌臨床分離株生物被膜中細菌數的對數與A570nm的相關性分析.

（A570nm：細菌生物被膜乙醇脫色液在570nm光波的吸光度；

Log10CFU：細菌生物被膜中細菌數的對數）

二、大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的分析

在所檢測的49株大腸埃希菌臨床菌株中，其中24株菌（49.0％）形成生物被膜的量較大（＋＋），18株（36.7％）形成生物被膜的量為中等（＋＋＋），7株菌(14.3％)形成生物被膜的量少（＋）。                                                                                  

討論

細菌在形成生物被膜的過程中，伴隨著某些性狀的變化，這些變化有些與菌體抗性的提高有關，如大量胞外多糖的產生，減低了抗生素向被膜內部的滲透；細菌在生物被膜狀態(tài)下，很多物質（特別是大分子物質）難以進行正常的物質交換作用，在被膜內部的細菌往往是處于一種低代謝、低能耗和低活性的狀態(tài)，導致菌體對抗生素的敏感性減低；被膜內部的菌株發(fā)生突變形成耐藥株等，這些變化都有利于提高菌體對抗生素的耐受性，研究報道細菌在生物被膜狀態(tài)的耐藥性比游離的單個菌體顯著提高[1-4]。此外生物被膜還可向周圍環(huán)境緩慢釋放浮游菌，成為潛在的感染源。故細菌生物被膜是細菌感染難以治愈或感染反復發(fā)作的重要原因。細菌形成生物被膜的厚度和體積大小不一，被膜的厚度和體積越大，往往抗性也越強。傳統(tǒng)的藥敏試驗測得的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentraton，MIC）是針對單個存在的細菌。據報道用傳統(tǒng)的藥物敏感試驗測得的某菌株對抗生素的MIC和生物被膜敏感實驗所測得細菌生物被膜的最小抑菌濃度（Biofilm inhibitory concentration，BIC)是不相同的，兩類藥敏試驗所選出的敏感藥物的種類也存在很大差別[8]。因此如不考慮細菌在感染機體形成生物被膜的特性，只依據傳統(tǒng)方法測得的MIC指導臨床抗生素的使用，對生物被膜菌感染的治療很難達到滿意的效果，因此臨床在使用抗生素治療生物被膜菌感染時應考慮細菌形成生物被膜的性。

本文采用平板培養(yǎng)法建立大腸埃希菌生物被膜的體外模型，并借鑒文獻報道的方法[6，7]建立了大腸埃希菌平板培養(yǎng)－結晶紫染色的生物被膜檢測方法，該法可分析大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成，具有一定的臨床應用價值。本研究對49株大腸埃希菌臨床菌株生物被膜的形成進行分析中，結果表明絕大多數大腸埃希菌臨床菌株能形成較厚的生物被膜。本研究結果提示在臨床治療大腸埃希菌相關感染時，若遇到依據傳統(tǒng)藥敏實驗結果進行抗生素治療效果不佳的情況，或大腸埃希菌感染久治不愈時，應考慮對致病菌株進行生物被膜的形成進行檢測，或做細菌生物被膜藥物敏感試驗，選擇細菌生物被膜敏感的抗生素，以提高大腸埃希菌感染的臨床治療效果。

參考文獻:

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